《微生物育种》PPT课件.ppt

第三章：微生物育种,微生物育种，无论从自然变异选择还是人工诱变的选择，都是建立在遗传和变异的基础上的。,工业微生物育种技术的发展，大致经历了如下阶段： 自然选育 微生物纯种培养法发明之后，开始了微生物纯种的自然选育。如当时的酒精发酵 ，纯系良种的推广，扭转了酒精生产不稳定的现象。这是最早应用微生物遗传学原理于微生物育种实践的一个实例。 诱变育种 40年代初，Beadle和Tatum“一个基因一种酶”学说的提出，意味着遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进了工业微生物育种技术的发展。如抗生素工业的兴起。 代谢控制育种 以50年代末Glu发酵成功为标志，其优势在于以诱变育种为基础，打破了微生物调节机制这一天然屏障，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地积累有用产物。代谢控制育种 的兴起意味着诱变育种发展到理性阶段，导致了氨基酸、核苷酸及某些次生代谢产物的高产菌株大批投入生产。,诱变育种是发酵工业育种的重要手段和技术，目前几乎所有工业生产菌种都经过诱变处理。,1、遗传性状稳定 2、纯净无污染 3、繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物 4、能诱变产生遗传性变异 5、产量高、收得率高,从自然界分离的野生菌株，在产量或质量上均难适合工业化生产的要求。理想的工业生产菌种必须具备：,微生物育种的途径：诱变、杂交、基因工程,诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传结构和功能，从中筛选出产量高、性状优良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。,诱变育种有以下几个优点：速度快，收效大、方法简单。,第一节 诱变育种,分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估,诱变育种的三大要素：诱变剂、诱变条件、筛选技术。,出发菌株的选择与纯化 单孢子（单细胞）悬液的制备 诱变剂及诱变剂量的选择 诱变处理方法 高产菌株的分离,诱变育种的步骤,对出发菌株的要求： (1)从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高； (2)在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的菌株； (3)采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株；,一、出发菌株,(4)有些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感性，故有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色色素的菌株作出发菌株时，只会使产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断提高； (5)采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株； (6)在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积少量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。,连续诱变育种过程中如何选择出发菌株 突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提高发酵水平不太容易。 在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加。,几乎每代出发菌株分别在发酵单位、菌落大小、菌落结构或颜色、基质菌丝颜色、可溶性色素以及生长速度等表型发生过变异，继续经诱变处理，产量又有显著的提高。 ,表：灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系,头孢菌素C产生菌C-20诱变系谱菌株表型变异与产量递增关系,这些表型上改变了的菌株，说明已动摇了遗传稳定性，继续处理，对诱变剂的敏感性就提高了，因而容易发生变异，易于达到育种目的,出发菌株的纯化 纯种分离方法，常用划线分离法和稀释平板法。 在诱变育种中，出发菌株的纯化虽然是辅助手段，但它是不可缺少的技术步骤，例如前面的例子中，灰黄霉素变种B-53，经自然分离，获得的变株C-04的产量比前者显著提高。 ,在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这样一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。 菌悬液是直接供诱变处理的，由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或缓冲液制备而成，其质量将直接影响诱变效果。对菌悬液的制备有如下的要求：,二、单孢子（单细胞）悬液的制备,供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮 ： 供试细胞培养物要新鲜，细胞生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性好。对细菌来说，常常通过前培养达到要求。,通常丝状菌菌株由于遗传分离产生不纯现象，一个多核细胞经诱变剂处理后，某个核发生有益的突变易被其他尚未突变的核竞争性地抑制，多核菌体会降低单位存活菌的突变率,制备菌悬液时，采取分散法，使细菌或孢子团块在培养液或悬浮液中充分分散，力求90%以上为单孢子。并务必除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的。 菌悬液的浓度，要求霉菌孢子浓度约为106mL-1，放线菌孢子浓度约为106-107mL-1。菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度法测定。 制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。,1、诱变剂种类选择： 不同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别，这不仅有细胞透性的差异，也与诱变剂进入细胞后相互作用不一致有关（修复机制）。 根据诱变剂作用机理，再结合菌种特性来选择诱变剂种类。例如，灰黄霉素野生菌使用氯化锂、紫外线效果好；头孢C产生菌比较有效的诱变剂是紫外线、氯化锂、甲基磺酸乙酯、博莱霉素；青霉素生产菌以亚硝基胍、氮芥、乙烯亚胺等烷化剂更为适合。 对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。 对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。 对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。,三、诱变剂及诱变剂量的选择,2、最佳剂量的选择： 经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株，宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。 要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株，则用强诱变剂和高剂量处理。 对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。,诱变处理方式： 单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低） 复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高）分下列几种情况： 1、两个以上因子同时处理 2、不同诱变剂交替处理 3、同一诱变剂连续重复使用 4、紫外线光复活交替处理 复合因子处理中，为了提高诱变效果，在具体使用时还要注意诱变剂处理先后和协同效应问题。,四、诱变处理方式,五、影响突变率的因素,菌种遗传特性 菌体细胞壁结构 培养条件和环境条件 诱变前预培养和诱变后培养（突变体的修复、表型迟延） 温度、pH、氧气等外界条件的影响 平皿密度效应,微生物通过诱变处理后，群体中产生各种类型突变体，有正突变、负突变和未突变的菌株，需要经过分离和筛选，逐一挑选出来。 随机突