《微生物遗传实验》PPT课件.ppt

微生物遗传实验,张充 2010年11月,实验一 微生物的诱发突变,实验二 抗药性突变株的分离,实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化、筛选,1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。,2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。,转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。,转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；,将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。,重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。,-互补现象： 因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。,由互补产生的半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。,重组DNA转化细菌过程示意图,3仪器、材料和试剂 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等； 菌株：E.coli DH5 质粒：pMD19-T+DNA 片段的质粒以及 pMD19-T空质粒； LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100gmL，X-gal 20-48g/ml, IPTG 100 g/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000储备液，用时按培养基的量再加入）； 预冷CaCl2溶液（0.1molL）,4操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法),（1）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养；,（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4，4000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；,（4）04，4000rmin离心10min； （5）弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，4000rmin离心10min； （6）弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。,2）细胞转化 (1) 分别取3个100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入1l重组质粒DNA(体积不超过10l)+ 100l感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，质粒DNA对照组1l+100l感受态细胞悬液。,(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42水浴中保温6090S，然后迅速冰上冷却2min (3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养约30min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。,3) 平板培养（有时需要稀释） 取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。,(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。 用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。,4) 检出转化体和计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示:,各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析,转化体总数菌落数（转化反应原液总体积/涂板菌液体积） 转化频率转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）,实验四 细菌的三亲接合实验,目的要求 1、了解细菌接合导致遗传重组的基本原理 2、学习细菌三亲接合实验的基本方法,基本原理,细菌接合是指供体菌和受体菌 完整细胞直接接合时供体菌 向受体菌单向传递而导致基因重组的现象。 供体菌：大肠杆菌DH5（带有可移动的抗性质粒，有转移起始位点，但没有自主转移基因） 辅助菌： E.coli HB101（带有自主转移的抗性质粒，编码诱动基因、转移基因） 受体菌：P.putida（本身没有质粒，染色体上有氯霉素抗性基因）,转移，但不能自我复制，被稀释,转移，且能自我复制,2. F因子及其在杂交中的行为(pp160-163),实验器材,菌株和质粒 辅助菌：E.coli HB101（pRK2013/mob+， tra+，Kmr，大小为25Kb左右，辅助质粒，可自主转移），卡那霉素使用浓度为50ppm（母液浓度为50000ppm，用无菌水配） 供体菌： E.coli DH5（pBBR1MCS-5/mob+， tra-，Gmr，大小为4.7Kb左右，可移动质粒），庆大霉素使用浓度为40ppm（母液浓度为40000ppm，用无菌水配） 受体菌：Pseudomonas putida (Cmr)，（菌株本身没有质粒、染色体上带有氯霉素抗性基因），氯霉素使用浓度为40ppm（母液浓度为40000ppm，用甲醇配）,实验器材,培养基 LB培养基、添加相应抗生素的LB固体培养基和液体培养基 溶液或试剂 卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、甲醇 仪器或其他用具 5ml离心管、灭菌镊子、细菌滤膜（灭菌）（0.25m）、移液器、涂布棒,实验步骤,1、分别在加有相应抗生素的LB培养基中培养供体菌、辅助菌、手提菌至对数中期（一般1012h）（pseudomonas putida于30培养，E.coli HB101和E.coli DH5 于37培养）,实验步骤,2、将三种菌液各取1mL至同一离心管中，5000rpm，5min离心收集菌体，无菌水洗涤两次（为了洗去抗生素），去上清，离心管倒扣至吸水纸上将残留液体去除干净。 3、加50l的无菌水重新悬浮菌体,实验步骤,4、用灭过菌的镊子取一张灭过菌的细菌滤膜放于LB平板上，用移液器转移菌悬液于滤膜上，静置20min后（水被吸干，菌体不流动），正放于30 培养箱过夜。 5、用灭过菌的镊子取滤膜置于LB液体（体积根据接合效率而定，一般3ml）中，洗下菌体，混匀。 6、取100 l菌液涂布于LB平板（氯霉素40ppm+庆大霉素40ppm）， 30 过夜培养，平板上长出的菌落