CathepsinB、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用.doc

Cathepsin B、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用【摘要】 目的: 探讨肝细胞肝癌（HCC）组织中组织蛋白酶B(CB)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体（uPAR）基因的表达、相互关系及作用，并分析其机制。方法: 应用RT-PCR方法测定71例肝组织标本，包括对照组（C）12例，HCC组34例和癌旁组织（PTT）组25例的CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA表达，分析其间的相关性。结果: HCC组CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA表达均明显高于C组和PTT组，差异有显著性（P <0.01），PTT组与C组间差异均无显著性（P >0.05）。CB mRNA与uPA mRNA（r0.805），CB mRNA与uPAR mRNA（r0.786），uPA mRNA与uPAR mRNA（r0.874）之间均存在显著的正相关关系（均P <0.01）。结论: 肝癌组织CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA均呈现高表达，它们之间可能相互诱导，协同促使肝癌的侵袭和转移。 【关键词】 癌 肝细胞 组织蛋白酶B 尿纤溶酶原激活物 尿纤溶酶原激活物受体 Expression，relationship and effect of gene of cathepsin B，urokinase-type plasminogen activator（uPA）and its receptor（uPAR）in hepatocellular carcinoma XU Chang-long*，ZHENG Jun-jie，XUE Zhan-xiong，HUANG Zhi-ming*Department of Digestive Medicine，the Second Affilated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325027 Abstract: Objective: To determine the expression, relationship and function of gene of cathepsin B (CB)，urokinase-type plasminogen activator（uPA）and its receptor（uPAR）in hepatocellular carcinoma，and to explore their effects and mechanism. Methods: The expression of CB mRNA，uPA mRNA and uPAR mRNA in 71 specimens of human hepatic tissue，including control (C) 12，hepatocellular carcinoma (HCC) 34 and paratumor tissue of hepatocellular carcinoma (PTT) 25 were detected with reverse transcription-polymerase chain raction (RT-PCR). The expression of relationship among CB mRNA,uPA mRNA and uPAR mRNA were researched. Results: The CB mRNA,uPA mRNA and uPAR mRNA in HCC were very significantly higher than those in C and in PTT（all P <0.01）；there had no significant difference between PTT and C (all P >0.05).There were significant correlation between the expression of CB mRNA and uPA mRNA（r0.805），CB mRNA and uPAR mRNA（r0.786），uPA mRNA and uPAR mRNA（r0.874）（all P <0.01）. Conclusion: The CB mRNA，uPA mRNA and uPAR mRNA show strongly expression in HCC and they may induce each other, promote cooperatively invasion and metastasis of HCC. Key words: hepatocellular carcinoma；cathepsin B；uPA; uPAR；neoplasm invasiveness；neoplasm metastasis 基底膜和细胞外基质是肿瘤细胞侵袭的第一道屏障。目前研究发现，组织蛋白酶B(Cathepsin B，CB)对基底膜和细胞外基质的降解是恶性肿瘤侵袭转移的关键步骤之一1,2，尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，uPA）与其受体（urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR）构成的uPA/uPAR系统介导的纤溶酶系统可能在其中发挥核心作用3，而它们在肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）演进过程中的变化特点、相互关系鲜见报道。本研究应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测肝细胞肝癌组织中CB、uPA和uPAR基因表达，分析其间的相关性，探讨它们在HCC侵袭转移中的作用和机制。 1 材料和方法 1.1 试剂与仪器 CB、uPA、uPAR、-action基因引物序列采用Primer Premier 5.0自行设计，由北京赛百盛基因技术有限公司代为合成，并用高效液相色谱法（HPLC）确认合成产物的纯度。Trizol总RNA提取试剂盒（Life Technologies公司生产）。PE2400 PCR扩增仪（Perkin璄mer公司生产）。 1.2 标本采集及分组 取自2002-2004年温州医学院第一、第二附属医院手术切除的肝组织。 所有标本离体30 min内经0.1% DEPC清洗后装入冻存管，置-140 oC液氮储存箱保存待用。分为：对照组（control，C组）12例（肝外伤手术标本，病理证实为正常肝组织）。肝细胞肝癌癌旁组织组（paratumor tissue of hepatocellular carcinoma，PTT组）25例（临床诊断为肝癌，根治性手术切除的癌旁组织，距肝癌原发灶5 cm以上，病理确认为晚期肝硬化）。HCC组34例（临床诊断为肝癌，根治性手术切除的标本，病理确认为HCC）。 1.3 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CB、uPA、uPAR基因 取50 mg标本组织，制成匀浆，冰浴下加入Trizl提取总RNA；采用M-MuLV按标准程序进行逆转录；续PCR扩增。基因引物序列为： CB mRNA: 正链 5瑼CA GCC CGA CCT ACA AAC AG?,负链 5瑿CA GTA GGG TGT GCC ATT CT?,产物为239 bp。 uPA mRNA：正链 5瑼TC AGC TTC ACA ACA GTC AT?，负链 5瑼GA ATT CAC CAC CAT CGA GA?，产物为474 bp。 uPAR mRNA：正链 5瑿AG ACT TGC TGT GTG ACC TCA?，负链 5瑼AT AAC AAC AAC ACA ACA GCG G?，产物为184 bp。-action：正链 5瑿AG CTA CAG CTT CAC CAC CA?，负链 5璆TC ACC TTC ACC GTT CCA GT?，产物为696 bp。电泳结束后取出凝胶，用Image master VDS成像系统摄影，图像分析软件(Total lab V101)行灰度扫描分析。以目的基因与-actin的PCR产物条带灰度值之比作为其mRNA水平的相对量。RT-PCR 反应体系中未加入逆转录酶的作为空白对照。 1.4 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件完成。多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析，方差齐性者用LSD法，方差不齐者行Games-Howell法。 2 结果 2.1 三组CB mRNA、 uPA mRNA和uPAR mRNA的表达情况 RT-PCR实验显示，HCC组CB mRNA、uPA mRNA和uPAR mRNA的产物条带亮度明显高于PPT组和C组，PPT组与C组的条带亮度差异不大（见图1、2、3）；HCC组CB mRNA、uPA mRNA和uPAR mRNA的条带光密度比值均高于C组和PTT组，差异有显著性（均P <0.01）。PTT组与C组比较三指标差异均无显著性（均P >0.05），见表1。 2.2 CB mRNA，uPA mRNA和uPAR mRNA表达的相关性分析 将全部71例肝组织RT-PCR实验的CB mRNA、uPA mRNA和uPAR mRNA表达做相关分析表明，CB mRNA与uPA mRNA（r0.805），CB mRNA与uPAR mRNA（r0.786），uPA mRNA与uPAR mRNA（r0.874）之间均存在显著的正相关关系（均P <0.01）。 3 讨论 CB属半胱氨酸蛋白水解酶，能在酸性环境中分解蛋白质，刺激肿瘤细胞生长，参与肿瘤血管生成，溶解基底膜、细胞外基质和结缔组织1，2，还可激活uPA4。uPA是一种由内质网膜系统合成的丝氨酸蛋白水解酶。uPAR是uPA的特异性受体，广泛存在于体内多种血细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞及某些肿瘤细胞上。uPA只有和uPAR同时表达时，才能发挥作用。uPAR可在细胞表面浓集uPA，而uPA又可上调uPAR的表达5。在uPAR的参与下，uPA对纤溶酶原的激活为正反馈逐级放大效应。CB、uPA及其激活的其他蛋白水解酶促进细胞外基质（包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和IV型胶原等）和血管基膜的降解6。uPAR与玻黏蛋白（vitronectin,VN）及整合素相互作用，增强细胞黏附，参与uPA信号传导和细胞趋化，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管生成7,8。 本研究结果显示，肝癌组织中CB、uPA和uPAR基因皆呈现高表达，表明恶性肿瘤的侵袭转移是一个多种细胞外基质降解酶参与的复杂变化。相关性分析显示，随着CB mRNA表达的增强，uPA mRNA和uPAR mRNA的表达也相应地增强，其间存在高度的正相关关系，表明它们对细胞外基质的酶解是相互联系、协同促进的，其可能是由于CB高表达诱导、激活uPA4，uPA又上调uPAR的表达5，进而促进uPA介导的纤溶酶系统降解细胞外基质和基底膜的连续过程而导致侵袭与转移。Sameni等9,10采用免疫荧光法对人类神经胶质瘤和乳腺癌细胞表面CB对IV胶原降解图像的分析也表明，CB既可以直接降解肿瘤细胞外基质，又可以通过激活蛋白水解级联的下游蛋白酶uPA，间接促进肿瘤细胞外基质降解。有实验显示，细胞表面存在膜联蛋白II异四倍体（annexin II heterotetramer, AIIt）结构，它是一种细胞表面结合蛋白，既能与CB前体结合，又能与单链和双链的成熟CB结合，在多种恶性肿瘤组织中表达上调，尤其是转移性癌细胞的表面；肿瘤细胞表面的AIIt可能提供一种对接平台或媒介，把CB和uPA等以及能被它们水解的底物连接到几近闭合的细胞表面，促进细胞外基质蛋白的降解，导致恶性肿瘤的侵袭转移11。【参考文献】 1 Podgorski I, Sloane BF. Cathepsin B and its role(s) in cancerprogressionJ. Biochem Soc Symp,2003,70(22):263-276.2 Roshy S, Sloane BF, Moin K. Pericellular cathepsin B andmalignant progressionJ. Cancer Metastasis Rev, 2003, 22(2-3):271-286.3 Macchione E, Epifano O, Stefanini M,et al. Urokinase redistribution from the secreted to the cell-bound fraction in granulosacells of rat preovulatory folliclesJ. Biol Reprod,2000, 62(4):895-903.4 Halangk W,Lerch MM,Brandt-Nedelev B, et al.Role of cathepsin B inintracellular trypsinogen activation and the onset ofacutepancreatitisJ. J Clin Invest, 2000, 106(6): 773-781.5 Montuori N, Mattiello A, Mancini A,et al. Urokinase-mediatedposttranscriptional regulation of urokinase-receptor expression in non small cell lung carcinomaJ. Int J Cancer, 2003,105(3):353-360.6 Agnantis NJ, Goussia AC, Batistatou A,et al. Tumor marker