CD147分子与MMPs在肝癌细胞系中表达的相关性.doc

CD147分子与MMPs在肝癌细胞系中表达的相关性 作者：王贤辉陈志南郭晓楠 【关键词】 CD147 关键词: CD147;基质金属蛋白酶;肝癌细胞 摘 要:目的 研究CD147与MMPs（基质金属蛋白酶）在肝癌细胞系中表达的相关性. 方法 流式细胞仪检测正常肝细胞QZG及不同肝癌细胞系（BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721，HHCC和HHCC-9204）中CD147的表达;酶谱法分析其产生MMPs的含量及活性. 结果 正常肝细胞株QZG中CD147表达阴性，其余5株肝癌细胞系CD147表达阳性;MMP-2和MMP-9在QZG和肝癌细胞系中均表达，但在肝癌细胞系中表达明显增高;MMP-9以酶原和活性形式表达，MMP-2仅以酶原形式表达;统计学分析CD147与MMPs表达成正相关. 结论 CD147可作为判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的标志. Keywords:CD147;MMPs;hepatoma cells Abstract:AIM To study the relation between CD147and the expression of MMPs in hepatoma cell lines.METHODS Expression of CD147in human liver cell QZG and different hepatoma cell lines（BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721，HHCC，HHCC-9204）was investigated by flow cytometer.Zymograph was used to study the content and types of posi-tive MMPs.RESULTS CD147was positively presented in five hepatoma cell lines，but in normal liver cell was nega-tive.MMP-2and MMP-9were detected by all the hepatoma cell lines and normal liver cell but the expression in hepatomacell lines was obviously high.The relation between CD147molecule and the expression of MMPs was a positive one.CONCLUSION CD147could be used as a marker to judge the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma. 0 引言 大量研究显示MMPs（基质金属蛋白酶）与多种肿瘤的侵袭转移有关1 ，其中IV型胶原酶（MMP-2明胶酶A和MMP-9明胶酶B）通过降解基底膜IV型胶原在恶性肿瘤早期的侵袭中起重要作用2，3 .CD147是新的细胞表面粘附分子，介导细胞间的粘附，具有TCSF/EMMPrin（肿瘤细胞起源的胶原酶刺激因子/细胞外基质金属蛋白酶诱导因子）的作用，而有助于癌细胞的侵袭转移4，5 .然而CD147在肝癌细胞表面的表达，以及肝癌细胞产生MMPs的形式及活性，尤其是两者的相关性研究未见报道.我们利用酶谱法（zymograph）及流式细胞仪对MMPs和CD147在肝细胞及肝癌细胞的表达进行研究，以揭示CD147与MMPs的相关性，并探讨以CD147为标志判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的可能性. 1 材料和方法 1.1 材料 抗CD147mAb为美国pharMingen公司产品，FITC-羊抗鼠IgG购自华美生物工程公司，ELITE ESP型流式细胞仪为美国库尔特公司产品，正常人肝细胞系QZG，人肝癌细胞株BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721和人肝癌细胞系HHCC均来自中科院上海细胞所细胞库，HHCC-9204由本室建立，培养用含有100mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养基. 1.2 方法 1.2.1 FCM定量检测CD147mAb的结合率 收集对数生长期的细胞制备高活性单细胞悬液至浓度（510）109 ・L-1 ，正常马血清封闭非特异位点加饱和CD147mAb5mg・L-1 4静置30min，DPBS离心洗涤2次加FITC-IgG孵育30min，4，离心洗涤后固定液固定，待测.同时设无关mAb抗乙脑病毒IgG为阴性对照. 1.2.2 细胞培养及细胞上清收集沉淀 上述6株细胞采用RPMI1640完全培养基培养，置于37含50mL・L-1 CO2 培养箱内，待细胞长满培养瓶（100mm15mm），用无血清RPMI1640培养液洗涤3次后加含20mL・L-1 胎牛血清RPMI1640培养3d，收集上清，梯度离心800g，15min，15000g，30min，上清用800g・L-1 饱和硫酸铵沉淀，4，8h，15000g，30min收集沉淀用10mmol・L-1 Tris-HCL，pH7.5透析除盐. 1.2.3 明胶酶谱法6 透析后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，其中分离胶含1g・L-1 的明胶.电泳结束后将凝胶置于洗脱液（25mL・L-1 Tristion X-100，50mmol・L-1 Tris-HCl，pH7.5，0.1mol・L-1 NaCl）室温洗2次，45min/次，接着将凝胶置于孵育液（50mmol・L-1 Tris-HCl，pH7.5，10mmol・L-1 CaCl2 ，0.2g・L-1 NaN3 ）37孵育24h以上，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色，蓝色背景上出现MMPs透亮带.经图像分析系统读取条带面积和酶解条带灰度，酶含量=条带面积（条带灰度背景灰度）. 统计学处理:结果以x s表示，分析线性相关性，检验相关系数. 2 结果 2.1 FCM测定CD147mAb标记细胞阳性率及平均荧光强度 CD147分子在不同肝癌细胞系中均表达阳性，以阴性对照荧光强度12.610.4为参照，CD147分子在HHCC中表达强阳性，在SMMC-7721中表达弱阳性，在正常肝细胞QZG中表达阴性（Tab1）. 表1 CD147在不同细胞系中的阳性率及平均荧光强度略 2.2 不同细胞系的明胶酶谱和MMPs酶含量的测定 不同细胞系的明胶酶谱显示在蓝色背景的3条透亮条带，A带为MMP-9酶原形式，分子质量92ku;B带为激活的MMP-9，分子质量86ku;C带为分子质量72ku酶原形式的MMP-2（Fig1）.经图像分析系统测定各明胶酶的含量（Tab2）. 图1 略 表2 MMPs在不同细胞系中的含量略 2.3 CD147荧光强度与MMPs9含量的相关性 经过统计学分析肝癌细胞与正常肝细胞QZG，CD147mAb平均荧光强度有明显差异（P<0.05），而其MMPs酶总量的分泌之间也具有明显差异（P<0.01）.6株细胞系CD147mAb平均荧光强度X与其MMPs总量Y之间经相关性检验相关系数r=0.9183，P<0.01.线性回归方程为Y=80370.4+2030.8X. 3 讨论 CD147分子属IgSF中高度糖基化的单次跨膜糖蛋白，主要参与细胞-细胞或细胞-基质的粘附.曾有实验表明表达于肺癌细胞系LX-1表面的该分子可刺激人成纤维细胞分泌MMPs而有助于癌细胞的浸润扩散7 .另有文献8，9报道肿瘤细胞表达的CD147分子可作用于邻近的癌细胞，相互诱导促进MMPs释放降解基质，并水解肿瘤细胞表面的粘附成分而有助于癌细胞的迁移.因此，CD147分子在肿瘤细胞的侵袭转移中起重要作用.我们的实验发现CD147分子在肝癌细胞系与正常肝细胞表面的表达呈现显著差异.另外，IV型胶原酶MMPs-2和MMPs-9的分泌及活性形式在两者之间亦有明显不同，在肝癌细胞中明显高于正常肝细胞.尤其以MMP-9的含量增高为主10 .据文献11，12报道，在恶性度高的肿瘤组织中MMP-9的表达上调而且其含量随癌细胞转移率的增高而增加，并以103ku，92ku的酶原形式及86ku的活化形式表达，表明MMP-9与肿瘤细胞的关系更为密切.我们的实验证实CD147分子表达于多株肝癌细胞表面，而正常肝细胞为阴性表达，同时检测了其培养上清中与恶性肿瘤转移密切相关的IV型胶原酶MMP-2和MMP-9的表达及活性形式.CD147分子的表达的确与MMPs的含量呈正相关，表明肿瘤细胞表面的CD147分子可刺激和激活自身MMPs的释放而促进癌细胞的侵袭转移，因此CD147分子可作为肝癌细胞侵袭转移的间接标志. 参考文献: 1Hideaki N，Frederick W.Mtrik metalloproteinases J.J Biol Chem，1999;274（31）:21491-21494. 2Stetler-stevenson WG，Hewitt R.Matrix metalloproteinase and tumor invasion:From correlaxion and causality to clinic J.Semin Cancer Biol，1996;7:147-154. 3K T ryggvason，M hoyhtya，T Salo.Proteolytic degradation of extracellular matrix in tumor invasion J.Biochem Biophy Ac-ta，1987;907:191-217. 4Guo XN，Chen ZN.Human hepatoma membrane-addociatedantigen Hab18g is indentified with CD147molecule J.Zhongliu Fangzhi Yanjiu（Cancer Res Prev Treat），2000;27（1）:7-10. 5Decastro R，Zhang Y，Guo H.Human keratinolytes express EMMPRIN an extracellular matrix metalloproteinase inducer J.J Invest Dermatol，1996;106:1260-1265. 6Thomas 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