p16、cyclinD1在胃癌及癌前病变中表达与胃癌的关系.doc

p16、cyclinD1在胃癌及癌前病变中表达与胃癌的关系【摘要】 目的 本研究通过检测p16、cyclinD1蛋白在正常胃粘膜、慢性萎缩性胃炎、胃粘膜不典型增生及胃癌中的表达，探讨p16、cyclinD1表达与胃癌发生发展的关系及作用机制。 方法 应用免疫组化S-P法检测慢性萎缩性胃炎、胃粘膜不典型增生及胃癌组织中p16、cyclinD1蛋白的表达情况。 结果 p16蛋白检测结果:p16蛋白在慢性萎缩性胃炎组中阳性表达率（87.5%）显著高于不典型增生组（53.8%）（P<0.05），不典型增生组与胃癌组（44.4%）之间无显著性差异（P>0.05）。cyclinD1蛋白检测结果:cyclinD1蛋白在慢性萎缩性胃炎组（29.2%）与不典型增生组（30.8%）之间无显著性差异（P>0.05），胃癌组中阳性表达率（52.7%）显著高于不典型增生组（30.8%）（P<0.05），p16与cyclinD1蛋白表达呈负相关系（r=-0.610，P<0.001）。 结论 胃癌发生机制涉及p16与cyclinD1基因的异常，随着病变进展，p16蛋白表达逐渐降低，cyclinD1蛋白表达逐渐升高，提示p16、cyclinD1可能是胃癌发生过程中的早期分子事件。 【关键词】 胃癌 免疫组 p16;cyclinD1 胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其病因及发病机制还未完全阐明。因此，深入探讨胃癌的发生发展规律，对揭示胃癌的发生机制具有重要意义。本研究利用免疫组织化学方法，对胃癌及癌前病变中p16、cyclinD1基因的表达产物进行分析研究，对揭示胃癌的发生、发展提供理论依据，为临床诊断和治疗提供参考。1 材料与方法 1.1 标本来源 收集河北省邯邢矿山管理局职工总医院病理科2000年2月2005年8月存档胃镜咬检的石蜡包埋胃粘膜组织50例（慢性萎缩性胃炎24例，不典型增生26例）及胃癌标本36例，均有完整的病理资料。所有标本常规石蜡包埋制成4m厚切片4张，其中一张切片HE染色进行病理形态学观察，其余3张切片用于免疫组织化学染色。 1.2 主要试剂 鼠抗人细胞周期素D1单克隆抗体（ZM-0084;克隆系:DCS-6）;鼠抗人p16单克隆抗体（ZM-0205;克隆系:16P07）;S-P试剂盒（sp-9000），DAB显色剂，为美国Santa Cruz公司产品，均购自北京中山生物技术有限公司。 1.3 免疫组织化学染色方法主要步骤 福尔马林固定、石蜡包埋的病理组织块切成4m厚切片，每个蜡块各作4张切片。第一张用于HE染色，第二张用0.01%PBS代替一抗作为阴性对照，第三、四张分别行抗p16、cyclinD1抗体标记p16、cyclinD1蛋白，免疫组织化学染色用链菌素亲生物素-过氧化物酶（S-P）法。 1.4 判断标准 p16参照Geradts1 标准，细胞核或细胞浆着棕黄色为阳性细胞。阴性（-）表示未见阳性着色细胞，或仅有胞浆着色而每高倍镜下胞核着色细胞个数1;弱阳性（+）表示着色较浅或着色细胞数25%者;阳性（+）表示着色深度适中或着色细胞数占25%50%者;强阳性（+）表示着色较深或着色细胞数>50%者;所有阳性样本必需满足每高倍镜下核着色细胞个数2。cyclinD1参考Betticher2 标准:未见阳性细胞或阳性细胞表达弱，与对照组正常上皮细胞表达类似<20%为阴性（-），中等强度的表达20%为阳性（+），50%为强阳性（+）。 1.5 结果判定 首先通过HE染色显微镜下观察，确定组织标本的病理特征，然后，在光镜下阅片，选择无组织折叠、无边缘效应等影响读片结果的典型部位，随意选取5个高倍视野并计数1000个细胞，以其平均数作为最后评定。分别由2位研究者独立阅片后再进行结果判定，不一致者共同读片后确定。 1.6 统计方法 应用SPSS10.0统计软件包，采用 2 检验、方差分析和Spearman等级相关分析方法。2 结果 2.1 p16蛋白在胃粘膜各病变中的表达 p16蛋白表达定位于细胞核和细胞浆内。在正常胃粘膜、慢性萎缩性胃炎、不典型增生、胃癌中的表达，见表1。在慢性萎缩性胃炎组中阳性表达率（87.5%）显著高于不典型增生组（53.8%）（P<0.05），不典型增生组与胃癌组（44.4%）之间无显著性差异（P>0.05），随着病变进展，其阳性表达率逐渐降低。 表1 p16蛋白在胃粘膜各病变中的表达 2.2 cyclinD1蛋白在胃粘膜各病变中的表达 cyclinD1蛋白表达定位于细胞核内。在正常胃粘膜、慢性萎缩性胃炎、不典型增生、胃癌中的表达，见表2，cyclinD1蛋白在胃癌组中阳性表达率（52.8%）显著高于不典型增生组（30.8%）（P<0.05），不典型增生组与慢性萎缩性胃炎组（29.2%）之间无显著性差异（P>0.05），随着病变进展，其阳性表达率逐渐升高。 表2 cyclinD1蛋白在胃粘膜各病变中的表达 类型 例数 阴性（%） 阳性（%）正常胃粘膜 21 16（76.2） 5（23.8）慢性萎缩性胃炎 24 17（70.8） 7（29.2）不典型增生 26 18（69.2） 8（30.8）胃癌 36 17（47.2） 19（52.8） 2.3 p16与cyclinD1表达的相关性 在p16阳性表达的16例胃癌中，cyclinD1阳性表达者3例（18.8%），在p16阴性表达的20例胃癌中，cyclinD1阳性表达者17例（85.0%），提示P16和cyclinD1在胃癌组织中呈负相关（r=-0.610，P<0.001），见表3。 表3 p16、cyclinD1蛋白在胃癌组的相关性表达 3 讨论 p16基因是由Kamb3 及Serrano4 发现的抑癌基因，定位于p21不到40kb的范围内，由三个外显子和两个内含子组成。三个外显子长度分别为126bp，307bp和11bp，编码一个16kD的蛋白，即p16蛋白。p16既是正常细胞周期有效调控者（负反馈调节作用），又是抑制肿瘤生长的关键成分。p16蛋白能与cyclinD1竞争性地结合CDK4和CDK6，抑制其活性，使其一系列底物（如pRb）保持持续去磷酸化高活性，而不能解除pRb对转录因子E2F等的抑制，从而阻止细胞G1期进入S期，直接抑制细胞增殖。相反，当p16基因发生突变、缺失时，p16蛋白不能正常表达，使细胞增殖失控，发生癌变。此外，在正常细胞中存在着一个负反馈网络5 ，即磷酸 化pRb增加时，可引起p16基因表达增强，增加的p16与cy-clinD1竞争性地结合CDK4，从而抑制CDK4活性，抑制细胞增殖。文献报道 6 胃癌中p16基因表达阳性率明显低于正常胃组织和非癌病变组织，本研究对胃粘膜各级病变p16蛋白的检测结果显示:各组样本中均有不同程度的p16蛋白表达，p16蛋白在慢性萎缩性胃炎组中阳性表达率显著高于不典型增生组（P<0.05），不典型增生组与胃癌组之间无显著性差异（P>0.05），随着病变从慢性萎缩性胃炎不典型增生癌的进展，其阳性表达率逐渐降低，提示p16基因表达缺失与胃癌发生、发展有关。与文献报道一致，同时提示p16为肿瘤抑制基因。cyclinD1基因是一种原癌基因，由351个腺嘌呤、392个胞嘧啶、376个鸟嘌呤和206个胸腺嘧啶组成。1992年Inaba等7 报道了cyclinD1基因在11q13的位置上。1994年Hinds等8 证实了cyclinD1有致癌作用。cyclinD1是细胞周期的正性调控因子的代表，与CDK4.CDK6结合并使之激活，活化的CDK4.CDK6使pRb（视网膜母细胞瘤蛋白）在G1-S转换期发生磷酸化，释放出E2F，进一步激活S期相关基因的转录，推动细胞从G1期进入S期9 。显然，cyclinD1表达异常引起的细胞周期失控是细胞异常增殖和癌变的原因，可能是胃癌发生的早期分子事件。Han10 认为34.4%的胃癌有cyclinD1表达。兰斌11 报告cyclinD1在胃癌中的阳性表达率为54.80%，明显高于癌旁组织（28.76%），而且与胃癌的转移与分化相关。本研究显示，各组样本中均有不同程度的cyclinD1蛋白表达，cyclinD1蛋白在胃癌组中阳性表达率显著高于不典型增生组（P<0.05），不典型增生组与慢性萎缩性胃炎组之间无显著性差异（P>0.05），随着病变从慢性萎缩性胃炎不典型增生癌的进展，其阳性表达率逐渐升高，与文献报道一致 12 ，提示cyclinD1基因的扩增可能发生在胃粘膜上皮癌变的早期阶段，是重要的胃癌促发因素，这也意味着该基因可能作为一个潜在的胃癌早期诊断分子标志。 p16和cyclinD1蛋白表达之间的相互关系:p16、cyclinD1均为重要的细胞周期调控基因，两者都与抑癌基因Rb有密切的关系。本研究表明胃癌p16与cyclinD1表达呈负相关。p16阳性的胃癌，cyclinD1阳性表达率低;p16阴性表达者，cy-clinD1阳性表达率高。提示处于分裂增殖状态的细胞p16表达减少，而cyclinD1表达增高，胃癌细胞增殖失去了p16的反馈性抑制而受到cyclinD1的促进作用，表现为无限增殖的倾向。p16失表达与cyclinD1高表达在胃癌的发生上可能具有协同作用，使肿瘤获得更大生长趋势。联合检测p16与cy-clinD1蛋白比检测单一基因产物更有价值，能为临床检测和诊断胃癌提供更多的生物学信息13 。【参考文献】 1 Geradts J，Kratzke RA，Niehans GA，et al.Immunohistochemical detec-tion of the cyclin-dependent kinase inhibitor2.multiple tumor suppressor gene1（CDKN2.MTS1）product p16INK4A in archival human solid tu-mors:correlation with retinoblastoma protein expression.Cancer J Res，1995，55（24）:6006-6011.2 Betticher DC，Heighway J，Hasleton PS，et al.Prognostic significance of CCND1（cyclin D1）overexpression in primary resected non-small-cell lung cancer.Br Cancer，1996，74（3）:294-300.3 Kamb A，Gruis NA，Weaver J，et al.A cell cycle regulator potentially in-volved in genesis of many tumor types.Science，1994，264（5157）:436-440.4 Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A newregulatory motif in cell-cycle con-trol causing specific inhibition of cyclin D.CDK4.Nature，1993，366（6456）:704-707.5 袁玉刚.抑癌基因p16与头颈部肿瘤.国外医学（耳鼻咽喉科学分 册），1998:22（1）:11-13.6 Liu F，Zhang X，Cao WD，et al.Correlation between the expression of p16and PCNA in grade of glioma.J Fourth Mil Med Univ，1999，20（7）:587-599.7 Inaba T，Matsushime H，Valentine M，et al.Genomic organization，chro-mosomal localization，and independent expression of human cyclin D genes.Genomics，1992，13（3）:565-574.8 Hinds PW，Dowdy SF，Eation EN.et al.Function of a human cyclin geneas an oncogene.Proc Natl Acad Sci USA.1994，91（2）:709-713.9 Dreyling MH，Bullinger L，Ott G，et al.Alterations of the cyclinD1.p16-pRb pathway in mantle cell lymphoma.Cancer Res，1997，57（20）:4608-4614.10 Han S，Kim HY，Park K，et al.Expression of p27Kip1and cyclin D1proteins is inversely correlated and is associated with poor clinical out-come in human gastric cancer.Surg Oncol，1999，71（3）:147-154.11 Lan Bin，Xu Dongpi，Lin Yongku.Expression of cycli