Zbtb7基因mRNA在佛波酯诱导的白血病细胞分化中表达上调.doc

Zbtb7基因mRNA在佛波酯诱导的白血病细胞分化中表达上调 作者：王黎芳，韩之波，黄颖，杜蓬，孙爱华【摘要】 目的 分析白血病细胞系分化前后Zbtb7基因mRNA表达水平的变化情况。方法 50nmol/L佛波酯(PMA)刺激6孔板培养的U937、K562白血病细胞系，在诱导刺激的0、1、3、5d，荧光定量PCR检测细胞内Zbtb7基因mRNA表达量的改变。结果 相对于正常培养的细胞，U937、K562细胞在PMA刺激后Zbtb7 mRNA表达增高，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)，且增高量存在时间依赖性。结论 白血病细胞分化过程中伴随有Zbtb7基因表达的改变。 【关键词】 白血病 Zbtb7基因 mRNA 表达ABSTRACT: Objective To detect the expression of Zbtb7 gene in Phorbol esters (PMA) induced differentiation of leukemia cell lines. Methods 50nmol/L PMA was used to induce the differentiation of U937 and K562 cell lines. The expression of Zbtb7 was detected by realtime PCR in the cells after induction on day 0, 1, 3 and 5, respectively. Results The expression of Zbtb7 in leukemia cell lines was markedly enhanced after treated by PMA (P<0.01, P<0.05, respectively) and the enhancement was in a timedependent manner. Conclusion The expression of Zbtb7 in leukemia is high. In the differentiation of leukemia cell lines, there is a variation of expression of Zbtb7 gene.KEY WORDS: leukemia; Zbtb7 gene; mRNA; expression原癌基因Zbtb 7位于人染色体19q13.3，编码一个与转录过程相关的蛋白因子，称为人FBI1(factor binding to IST of human immunodeficiency virus1)，或称Pokemon(POK erythroid myeloid oncogenic factor)。这一基因发现至今不到10年。人FBI1与鼠源的白血病淋巴相关因子(leukemia/lymphomarelated factor, LRF)、兔源的造血干细胞来源的破骨细胞锌指蛋白(steoclastderived zinc finger, OCZF)有85%的同源性1，提示Zbtb7基因在人白血病发病、进展过程中可能存在一定的功能。为了研究Zbtb7在白血病细胞系中的表达情况，我们以佛波酯(PMA)诱导分化的U937和K562细胞为模型，采用realtime PCR相对比较法检测和分析Zbtb7在细胞分化前后mRNA表达量的改变。1 材料与方法1.1 材料B系急性淋巴细胞白血病细胞Nalm6、人B淋巴瘤细胞Daudi、人巨核细胞白血病细胞Mo7e、急性淋巴人白血病细胞Molt4、前B细胞REH、急性单核细胞白血病细胞U937、红白血病细胞K562、T淋巴细胞HPB、人红白血病细胞系HEL、早幼粒白血病HL60由本实验室常规方法传代和培养。TRIzol、MMLV逆转录试剂盒购买自Invitrogen公司；佛波酯(Phorbol esters, PMA)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)购买自Sigma公司；IMDM购买自GIBCO公司；FCS购买自天津血液研究所，0.22m滤膜过滤除菌；SYBR Green荧光定量PCR反应试剂盒购买自美国SYBR Green公司。1.2 cDNA的制备各细胞系培养至对数生长期，各取1106个细胞加入TRIzol提取RNA，MMLV逆转录成cDNA。1.3 白血病细胞系的诱导分化人急性单核细胞白血病细胞系U937细胞以IMDM、100mL/L FCS、100u/mL青霉素0.1mg/mL链霉素为培养体系进行培养。至生长状态最佳时接种于6孔培养板，每孔5mL培养基接种1106个细胞，培养体系采用IMDM、150mL/L FCS、100u/mL青霉素0.1mg/mL链霉素。PMA以DMSO溶解成贮存液，浓度为162mmol/L，加入U937细胞培养体系成工作浓度为50nmol/L。培养1、3、5d时，弃上清，PBS清洗已贴壁分化的细胞后，以终质量浓度为2.5g/L的胰酶消化。取1106个细胞加入TRIzol提取RNA，MMLV逆转录成cDNA。 人红白血病K562细胞以IMDM、100mL/L FCS、100u/mL青霉素0.1mg/mL链霉素为培养体系进行培养。至生长状态最佳时接种于6孔培养板，每孔5mL培养基接种1106个细胞，培养体系采用IMDM、150mL/L FCS、100u/mL青霉素0.1mg/mL链霉素。PMA以DMSO溶解成贮存液，浓度为162mmol/L，加入K562细胞培养体系成工作浓度为50nmol/L。培养1、3、5d时，900g离心10min，取1106个细胞加入TRIzol提取RNA，MMLV逆转录成cDNA。1.4 荧光定量PCR基于FBI1cDNA(BC084568)序列采用Stanford University Primer Design softwar(/cgibin/SGD/webprimer)进行引物设计，送上海生工合成。上游引物Fw：5GAAGCCCTACGAGTGCAACATC3，下游引物Rev：5GTGGTTCTTCAGGTCGTAGTTGTG3，扩增产物147bp。以actin(AK225414)为内参进行相对定量，上游引物Fw：5CAGAGCAAGAGAGGCATCC3，下游引物Rev：5CTGGGGTGTTGAAGGTCTC3，扩增产物217bp。SYBR Green荧光定量PCR反应体系：20L DDW，25L SYBR Green Mix，1.5L Primer Fw，1.5L Primer Rev，2L cDNA。反应条件：50 2min 1个循环，95 15min 1个循环，94 15s、58.5 30s、72 30s共35个循环。每一时间点取3个重复样本。CT(目的基因)=目的基因CT-内参基因CT，10种细胞系Zbtb7表达量的检测结果以2-CT表示。PMA诱导分化实验，采用2-CT检验基因的表达变化2，以未刺激的时间点为标准值。CT=CT(目的基因)-CT(标准值)，目的基因的相对总量为2-CT。1.5 统计学处理结果用均数标准差(s)表示，计量资料组间比较采用两组随机化设计资料均数的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Zbtb7 在白血病细胞中广泛表达Zbtb7在本实验所检测的10种白血病细胞系中均有表达。Nalm6、Daudi、Mo7e、Molt4、REH、U937、K562、HPB、HEL和HL60相对于actin的表达量分别为：2-5.750.32、2-6.070.34、2-5.710.22 、2-5.710.32、2-5.740.32、2-5.620.08、2-5.680.03、2-5.150.29、2-5.950.33和2-4.930.27。2.2 PMA刺激后的U937细胞Zbtb7 mRNA的表达量 U937在50nmol/L PMA刺激1d后Zbtb7表达显著增加(P<0.01)，并随着刺激时间的延长、细胞的分化表达进一步增强，35d表达量维持恒定(P<0.05，表1)。表1 50nmol/L PMA刺激后U937细胞中Zbtb7的表达（略）2.3 PMA刺激后的K562细胞Zbtb7mRNA的表达量K562在50nmol/L PMA刺激1d后Zbtb7表达量上升(P<0.05)，随着刺激时间的延长表达量呈上升趋势(表2)。表2 50nmol/L PMA刺激后K562细胞中Zbtb7的表达（略）3 讨 论FBI1属于BTB/POZZF蛋白家族成员。这个家族成员在DNA损伤、细胞周期、造血干细胞分化等生理生化反应中具有重要的功能。FBI1与肿瘤的生成、细胞增殖紊乱直接或间接相关3。作为一个新发现的原癌基因，目前已经在T细胞淋巴细胞瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤以及乳房、肺、膀胱、前列腺肿瘤、非小细胞癌、T4D7肺癌细胞系中发现了Zbtb7基因的异常高表达46。而对人不同白血病细胞系Zbtb7 mRNA水平的检测发现，在HG2、Jurket、K562细胞内高表达，而在Nalm6、Daudi中表达相对弱一些6。本研究对选取的10种白血病细胞系进行检测，结果发现Zbtb7 mRNA均有表达，提示Zbtb7在白血病细胞系中存在广泛的表达。但是，并不是所有的肿瘤细胞都呈现FBI1蛋白的高表达的，这可能与不同肿瘤细胞的组织特异性有关，也与肿瘤细胞所处的恶性状态和细胞周期有关系。比如，P2白血病细胞中FBI1的表达很弱，而在成骨肉瘤细胞UMR中则根本无表达7。 目前，许多化疗药物都能促进白血病细胞分化，如PMA可诱导K562向巨核系分化、诱导U937细胞向巨噬细胞系分化8。不同的诱导因素通过不同的信号转导途径，引起不同的生物效应。同一诱导因素，因细胞类型不同，也可经不同的信号分子级联，产生不同的调节作用，导致目的基因表达的升高或降低。我们的研究结果显示，PMA刺激诱导分化的K562和U937细胞内均存在Zbtb7 mRNA表达量的增高，提示在诱导分化早期，PMA能在转录水平上促进Zbtb7的表达。ASTIER等9的研究结果显示，在一些Zbtb7低表达的白血病细胞系，如ALL前B细胞系Nalm6细胞，无血清培养于纤连蛋白(fibronectin，Fn)包被的培养板后，Zbtb7基因表达是增高的，尤其是在刺激12d后。但是，DAVIES等6以第169位核苷酸起始的引物能扩增出Zbtb7 mRNA 3种前体形式，其中B型和C型的mRNA在用维甲酸刺激过的人红白血病细胞系K562向粒系巨噬细胞分化过程中的表达却低于未刺激的细胞。Zbtb7的表达在不同的组织中及个体发育的不同阶段存在着复杂的表达调控，一旦调控失常，Zbtb7的表达量发生改变，病理水平的转录因子将影响其所调控的目的基因的表达，而造成细胞水平的异常。BTB/POZZF蛋白家族的另一个转录因子锌指蛋白PLZF，其POZ结构域与FBI1高度同源，在巨核细胞生成过程中表达增高10。BTB/POZZF蛋白家族成员在个体发育及组织分化过程中表达水平改变的具体生理意义尚需进一步研究。Zbtb7在细胞转录水平上量的差异显示了其作为抑制肿瘤治疗靶点的研究前景。后续的研究将着眼于白血病患者治疗前后外周血单个核细胞中Zbtb7是否高表达，从而从整体水平阐述Zbtb7高表达的临床意义。【参考文献】 1LEE DK, SUH D, EDENBERG HJ, et al. POZ domain transcription factor, FBI1, represses transcription of ADH5/FDH by interacting with the zinc finger and interfering with DNA binding activity of Sp1 J. J Biol Chem, 2002, 277(30):2676126768.2LIVAK KJ, SCHMITTGEN TD. Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2CT Method J. Methods, 2001, 25(4):402408.3KELLY KF, DANIEL JM. POZ for effectPOZZF transcription factors in cancer and development J. Trends Cell Biol, 2006, 16(11):578587. 4MAEDA T, HOBBS RM, MERGHOUB T, et al. Role of the protooncogene Pokemon in cellular transformation and ARF repression J. Nature, 2005, 433(7023):278285.5APOSTOLOPOULOU K, PATERAS IS, EVANGELOU K, et al. Gene amplification is a relatively frequent event leading to Zbtb7A (Pokemon) overexpression in nonsmall cell lung cancer J. J Pathol, 2007, 213(3):294302.6DAVIES JM, HAWE N, KABROWSKI J, et al. Novel BTB/POZ domain zincfinger protein, LRF, is a potential target of the LAZ3/BCL6 oncogene J. Oncogene, 1999, 18(2):365375.7KUKITA A, KUKITA T, OUCHIDA M, et al. Osteoclastderived zinc fi