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二甲双胍治疗后多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜Hoxa10的表达及意义 作者：李晓冬 马毓梅 张杰英 王玮 郝桂敏 蔡建辉 【关键词】 胰岛素；多囊卵巢综合征；子宫内膜 【Abstract】 AIM: To study the protein expressions of Hoxa10, insulin (INS) and insulin receptor (INSR) in the endometrium of polycystic ovarian syndrome (PCOS) rat before and after therapy with metformin. METHODS: Fiftyfour female SD rats aged 85 d were divided into control group (n=20), PCOS model group (n=17) and metformin treatment group (n=17) randomly. The rats in the latter 2 groups were induced by Poretskys method for PCOS modeling, followed by administration of placebo or metformin respectively. After 14 d treatment, the rats were sacrificed and the expressions of Hoxa10, INS and INSR in endometrium were detected by ElivisionTM Plus twostep staining. Serum testosterone and insulin were also detected. RESULTS: The expressions of Hoxa10 and INSR were decreased (P<0.01, P=0.012) in the endometrium of PCOS group but that of INS was increased (P=0.003). In the metformin treatment group, Hoxa10 expression was raised （P<0.01） and INS level declined （P=0.043）, which were lower than the levels of control group (P<0.01, P=0.037). There was little change for INSR. Serum testosterone and insulin declined after metformin treatment (P<0.01, P=0.048). CONCLUSION: INS resistance and decreased endometrial receptivity mayexist in the endometrium of PCOS rats, which can partially be corrected with metformin. 【Keywords】 insulin; polycystic ovarian syndrome; endometrium 【摘要】 目的: 探讨二甲双胍治疗前后多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠子宫内膜组织中Hoxa10及胰岛素（INS）、INS受体（INSR）蛋白表达的变化. 方法: 选取85日龄SD雌性大鼠54只，随机分为： 对照组（20只）； PCOS组（17只）； 二甲双胍治疗组（17只）. 后两组先参照Poretsky L等方法复制PCOS大鼠模型，造模成功后，PCOS组喂服安慰剂，治疗组喂服二甲双胍,14 d后断头处死各组大鼠并取材. 采用免疫组织化学ElivisionTM Plus两步法检测三组子宫内膜Hoxa10及INS，INSR蛋白的表达. 并取外周血测定INS和睾酮含量.结果: PCOS组大鼠子宫内膜Hoxa10和INSR表达下降(P<0.01, P=0.012)，INS表达增加(P=0.003)；二甲双胍治疗后子宫内膜Hoxa10表达增加（P<0.01），INS水平下降（P=0.043），但均低于对照组水平(P<0.01, P=0.037)；INSR无明显变化；治疗后血INS和血睾酮水平均下降(P<0.01, P=0.048). 结论: PCOS大鼠子宫内膜可能存在INS抵抗和容受性下降，治疗后可部分逆转此变化. 【关键词】 胰岛素；多囊卵巢综合征；子宫内膜 0引言 多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄妇女常见的妇科内分泌疾病. 主要以慢性无排卵、不孕为特征. 胰岛素(INS)抵抗及由此而引起的高INS血症是PCOS的主要发病环节之一1. 临床上针对高INS血症给予降INS治疗后PCOS患者的排卵率明显升高，但妊娠成功率不高. 子宫内膜容受性与妊娠成功与否密切相关，但目前对于PCOS及其治疗的基础研究中对子宫内膜的观察还很少. 本实验旨在观察高INS的PCOS大鼠模型在降INS药物治疗前后大鼠子宫内膜同源框基因Hoxa10及INS，INS受体(INSR)蛋白表达的变化以及血激素水平的变化，探讨降INS治疗对PCOS子宫内膜容受性的影响以及增强内膜容受性的可能途径，以期指导临床提高PCOS妊娠成功率. 1材料和方法 1.1材料85日龄SD雌性大鼠54只， 体质量（11010）g（河北医科大学动物中心）；Hoxa10（Santacrui公司，sc17159），羊抗多克隆抗体，效价150；INS（Neomarkers公司，MS1378），鼠抗mAb，效价150；INSR（Neomarkers公司，MS636），鼠抗mAb，效价150；ElivisionTM Plus免疫组化试剂盒（福州迈新试剂公司）；血睾酮和INS试剂盒（Beckman coulter 公司）. 1.2方法 1.2.1动物模型制备与分组将大鼠随机分为对照组（20只）， PCOS组（17只）和二甲双胍治疗组（17只）.对照组大鼠经皮下给予注射用水1 mL，2次/d. 后两组参照Poretsky等2的方法，经皮下注射绒毛膜促性腺激素3.0 U及INS 6 U，2次/d，22 d后检测阴道涂片和血激素水平符合PCOS模型，给动物分别喂服安慰剂和二甲双胍（按人与大鼠的公斤体质量折算系数计算剂量），1次/d，14 d后断头处死各组大鼠，取躯干血，分离血清，测定血清INS和睾酮水平. 打开腹腔，观察双侧卵巢和子宫的大体形态并以100 mL/L多聚甲醛固定, 石蜡包埋. 1.2.2光镜下形态学观察取卵巢及子宫石蜡包埋组织，4 连续切片8张，常规HE染色光镜观察. 1.2.3免疫组化检测子宫内膜Hoxa10及INS，INSR的表达取子宫切片，常规脱蜡至水、ElivisionTM Plus两步法，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜观察. INSR需抗原修复. Hoxa10，INS和INSR阳性信号分别为细胞质、细胞质、细胞膜呈棕黄色颗粒. 对腺上皮细胞和间质细胞分别计分. 免疫组化半定量方法参考Mccarthy方法按染色强度（i）分为弱(淡黄)、中(黄)、强(棕黄)三等，并分别记为1，2，3分. 观察切片，计算各染色强度的细胞所占百分比（Pi）. 每张染色片的蛋白表达评分（H）=(i1)Pi. H值范围为04；0分为所有细胞均无染色，4分为所有细胞均为强染色，04之间为不同程度的蛋白表达水平. H<1为阴性. 所有切片均由2名有经验的病理科医师采用双盲法评估算分. 对少数不易判断的切片重新共同阅片而定. 1.2.4激素测定Access免疫分析系统定量检测血清INS和睾酮水平. 统计学处理: 所有数据均以xs表示，采用SAS 6.12统计软件进行数据统计分析. 多组间比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA），组间比较采用q检验，以P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1卵巢的大体和形态学变化对照组大鼠卵巢色泽红，可见黄体. 镜下除多个黄体外，可见不同发育阶段的卵泡，优势卵泡颗粒细胞层数89层. PCOS组卵巢表面较苍白,体积增大,见不到或仅见少量黄体形成. 镜下见卵泡扩张，卵母细胞或放射冠消失,颗粒细胞层数减少至23层，部分卵泡闭锁. 治疗组卵巢色红，可见到黄体. 镜下可见多个黄体及各级卵泡. 卵泡囊性扩张减少或消失，颗粒细胞层数增多，优势卵泡内可见到卵池液、卵丘(图1A,C,E). 2.2子宫内膜的形态学变化各组子宫内膜腺体形态明显不同. 对照组大鼠子宫内膜腺体为多个腺体簇状排列,腺腔大而多褶,腺上皮中可见分泌泡. PCOS组子宫内膜腺体数目减少,为单个腺体分散排列，腺腔小而直. 治疗组子宫内膜腺体数目增多，出现簇状排列，但腺腔多小而直，部分可见到皱褶和分支(图1B,D,F). A：对照组卵巢；B：对照组子宫内膜；C：多囊卵巢综合征组卵巢；D：多囊卵巢综合征组子宫内膜；E：治疗组卵巢；F：治疗组子宫内膜. 图1三组卵巢及子宫内膜的病理观察HE 200（略） 2.3免疫组化染色结果显示三种抗体在各组子宫内膜均有表达，但具体表达强度明显不同(图2，表1). 统计分析表明，PCOS组腺上皮Hoxa10表达水平明显低于治疗组和对照组(P<0.01),治疗组低于对照组(P<0.01). INS表达水平在PCOS组明显升高(P=0.003)，治疗组降低(P=0.043)但仍高于对照组(P=0.037). INSR在PCOS组和治疗组表达明显降低(P=0.012, P<0.05)，但PCOS组和治疗组之间无明显差别. 2.4激素水平的变化PCOS组的血睾酮和血INS水平均较对照组明显增高(P<0.01)，治疗组INS与PCOS组相比明显降低(P<0.01),但仍高于对照组水平(P<0.01). 治疗组血睾酮与PCOS组相比有所下降(P=0.048)但仍高于对照组水平(P<0.01，表1). 3讨论 PCOS患者多表现为不孕,以往对于它的研究多集中于降低激素水平和促排卵治疗方面. 人们对于PCOS大鼠也多观察其外周血及卵巢的变化,但在临床上发现当激素水平得到改善、促排卵成功后,仍没有满意的妊娠结局,因此推测内膜结构和功能的改变也起着很重要的作用. 近年来研究 3 发现子宫内膜不仅是卵巢激素作用的靶器官，也具有表达许多因子和受体以调节自身的功能，从而影响妊娠结局. HOX基因是近年来发现的一类在胚胎发育方面发挥重要作用的基因，其家族成员Hoxa10位于人类染色体7p15.3，是参与子宫内膜殖分化和子宫内膜容受性建立的重要指标4,在人正常月经周期的分泌中期(着床期)和晚期，子宫内膜Hoxa10表达显著升高5，而基因表达降低或丧失将导致生育力下降. Hoxa10的表达受性激素的调节6. 曾有人 7利用ISHIKAWA细胞进行研究发现，雄激素可以降低细胞Hoxa10的表达，雌孕激素上调内膜水平Hoxa10的表达. A：PCOS组 Hoxa10； B：治疗组Hoxa10；C：PCOS组INS-R；D：治疗组INS-R；E：PCOS组INS；F：治疗组INS. 图2多囊卵巢综合征组（PCOS）及治疗组的子宫内膜Hoxa10，胰岛素受体（INS-R）及胰岛素（INS）的表达ElivisionTM Plus两步法 200（略） 表1各组子宫内膜Hoxa10、胰岛素(INS)、胰岛素受体(INSR)的表达及血睾酮、血INS的变化（略） aP<0.05, bP<0.01 vs对照组； cP<0.05, dP<0.01 vs PCOS组； eP=0.048 vs PCOS组. PCOS: 多囊卵巢综合征. 我们所采用的是高INS的PCOS模型，同时血中雄激素呈现高水平, 多种研究表明INS抵抗与PCOS的发病有密切关系，INS水平的变化也同样影响子宫内膜的改变8-9 . 根据我们的实验结果,推测高水平的INS干扰了PCOS大鼠子宫内膜正常的生理活性，子宫内膜INS受体水平降低或敏感性下降，INS代偿性增加，INS不能发挥正常的活性，表现为内膜水平的INS抵抗现象. 同时PCOS大鼠排卵障碍，无孕激素产生，雄激素水平升高，使内膜水平的HOXA10明显受到抑制，表现为子宫内膜容受性下降. 因此推测PCOS大鼠子宫内膜INS抵抗和容受性降低也是PCOS大鼠生育能力下降的一个潜在因素. 二甲双胍是近年来临床采用的针对PCOS高INS水平治疗的常用药物10. 我们的结果显示在应用二甲双胍治疗后，PCOS大鼠外周血INS和雄激素水平比治疗前明显下降，并以INS下降更为显著. 在子宫内膜方面也有变化，表现为INS水平下降，Hoxa10水平上升，排卵功能恢复，但INS受体水平变化不明显，INS抵抗现象和容受性得到改善. 因此其容受性的提高可能与组织对INS敏感性的增加有关. 但经二甲双胍治疗后，Hoxa10的表达水平并没有完全恢复到正常，考虑PCOS时的子宫内膜功能异常不仅仅与INS抵抗有关，而是由多因素参与的，故仅应用降INS治疗并不能完全纠正这种内膜缺陷，但如何有效增加子宫内膜容受性尚有待进一步研究. 【参考文献】 1 Tan S, Hahn S, Janssen OE. Insulin resistance syndrome and polycystic ovary syndrome: Implications for diagnosis and treatmentJ. Panminerva Med, 2005, 47(4): 211-217. 2 Poretsky L,Clemons J,Bogovich K. Hyperinsulinemia and human chroionic gonadotropin synergisticallu promote the growth of ovarian follicular cysts in ratsJ. Metabolism， 1992,41(8):903-910. 3 Maliqueo M,Clementi M,Gabler F, et al. Expression of steroid receptors and proteins related to apoptosis in endometria of women with polycystic ovary syndrome J. Fertil Steril， 2003，80(Suppl 2):812-819. 4 Daftary GS, Taylor HS. Pleiotropic effects of HOXA10 on the functional development of periimplantation endometrium J. Mol Reprod Dev,2004,67(1): 8-14. 5 Kim JJ, Fazleabas AT. Uterine receptivity and implantation: The regulation and action of insulin like growth factor binding protein 1 (IGFBP1), HOXA10 and forkhead transcription factor 1 (FOXO1) in the baboon endometrium J.Reprod Biol Endocrinol, 2004,16(2): 34-40. 6 Mylene MW, Lim H, Schust DJ. Gene expression profiling reveals progesteronemediated cell cycle and immunoregulatory roles of hoxa10 in the preimplantation uterusJ.Molecular Endocrinol, 2003,17(4):610-627. 7 Cermik D,Selam B, Taylor HS. Regulation of HOXA10 expression