人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达.doc

人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达【摘要】 目的: 制备人核迁移蛋白（hNudC )的单克隆抗体（mAb）并鉴定其特性。方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET28b/hNudC, 表达带有6His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性。结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM() , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为164和132; 腹水mAb的效价分别为11105和15104。mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg01和人脐带血来源的CD41巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白。结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、 天然分布及异常表达奠定了基础。 【关键词】 人核迁移蛋白; 单克隆抗体; 巨核细胞 人核迁移蛋白C 基因(human nuclear distribution C, hNudC), 定位于第1号染色体1p34p35, 编码331个氨基酸, 基因全长为8 kb。NudC进化上保守, 从构巢曲霉、 果蝇、 小鼠等生物均能找到同源物, 人类 NudC羧基末端的94个氨基酸与构巢曲霉的同源性为67%, 与果蝇的同源性为76%, 与大鼠的同源性为98%。NudC的C末端12个氨基酸, 在所有的种类中都被保留1。hNudC在人体组织中广泛表达, 提示hNudC具有重要的生物学功能2。早期的生物学活性的研究表明, hNudC与其家族成员(包括胞质动力蛋白、 肌动蛋白、 LIS1和NUDE)相互作用, 和微管一起参与细胞增殖3、 正常的造血4、 神经细胞形成等。近期研究进一步证明, hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用5。这些资料为 hNudC的功能研究提供了新的方向。 为了进一步研究hNudC蛋白的结构与功能, 探索hNudC对于造血细胞的增殖、 分裂的功能和影响, 迫切需要hNudC的特异性抗体, 但现在并无相应市售抗体。为此, 本研究拟用纯化的重组hNudC蛋白为免疫原, 利用经典的淋巴细胞融合技术, 建立稳定分泌特异性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株, 并对得到的mAb进行鉴定, 检测hNudC蛋白在人巨核细胞中的表达情况和亚细胞定位, 为进一步探讨hNudC蛋白的结构和功能提供工具。 1 材料和方法 1.1 材料 弗氏完全佐剂购于Sigma公司。蛋白表达载体pET28b(+) 购自Invitrogen公司; 工具酶购自MBI Fermentas公司; 质粒DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自Omega公司; 亲和层析柱TALON Spin Column购自CLONTECH公司; Dynal CD34 祖细胞分选系统 Prod.No. 113.01购自 Dynal Biotech, Norway公司。造血干细胞无血清培养液StemSpan H2000购自Stem Cell Technologies公司; 淋巴细胞分离液FicollPaqueTM Plus (1 077 g/L)购自Amersham Biosciences公司。IMDM (Iscoves Modified Dulbeccos Medium)培养基粉末: 购自Gibco公司; 胎牛血清FBS购自Gibco公司。重组人的rhTPO购自于Sigma公司。FITC 标记的CD41 mAb、 藻红蛋白（PE）标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）、 FITC 标记的二抗兔抗鼠IgG（H+L）等抗体购自于Southern Biotechnology Associates公司。BALB/c小鼠和健康成年雄性Wistar大鼠由中山大学实验动物中心提供。白血病巨核细胞系Dami、 Meg01购自中国科学院上海细胞库。其他化学试剂购自Sigma 公司。 1.2 方法 1.2.1 外源基因蛋白的表达和纯化 将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3), 挑取单个克隆接种于LB/Kan (50 mg/L)培养液中, 37培养过夜。取上述过夜菌液按比例接种于新鲜的LB/Kan培养液, 剧烈振荡, 37培养23 h至A600为0.50.6, 加异丙基硫代BD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5 mmol/L, 30继续继续剧烈振荡培养3 h 。离心收集菌体沉淀, 超声波破碎细胞壁后, 常规TALON Metal Affinity Resin 亲和柱进行蛋白纯化, 最后用FPLC System色谱仪进一步纯化表达产物。电泳鉴定目的蛋白的相对分子质量（Mr）和表达产量。透析过夜, BioRad法测定蛋白质浓度后, -80保存备用。 1.2.2 杂交瘤细胞的建立 用0.5 mL纯化的hNudC 蛋白(1.7 g/L)与等量福氏完全佐剂混合并完全乳化后, 经腹腔注射免疫BALB/c小鼠(0.1 mL/只) 。加强免疫时, 用福氏完全佐剂充分乳化抗原, 注射剂量和部位同前, 共免疫4次, 每次间隔2周。最后1次直接用抗原溶液进行免疫。末次免疫后3 d, 取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用间接ELISA法筛选mAb分泌阳性的杂交瘤细胞。经34次有限稀释法克隆化后, 选择2株mAb分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养, 并按常规制备腹水。 1.2.3 mAb的效价测定 采用间接ELISA法。用hNudC (1 mg/L)包被聚苯乙烯板。一抗为适当稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水样本, 二抗为13 000的HRP羊抗鼠IgG, 经TMB底物显色后, 于波长450 nm测定A值。 1.2.4 Ig亚类(型)的鉴定 参照试剂盒中的说明书进行。用PBS将杂交瘤细胞培养上清进行10倍稀释, 取150 L滴加到测试管中, 使蓝色胶乳完全重悬。将抗体测定试纸条的黑色一端插入到试管的底部, 待蓝色的阳性控制线条出现时, 取出测试条, 2 min后读取结果。 1.2.5 抗血清反应特性的Western blot 分析 将hNudC 蛋白进行 SDSPAGE分离, 电转移到硝酸纤维素(NC) 膜上, 在封闭液中37缓慢摇动2 h , 用洗涤液洗3次, 与10-3稀释的 hNudC mAb 在37孵育1 h , 用洗涤液洗3 次, 每次15 min; 与适当稀释的兔抗鼠 IgGHRP 在37孵育1 h , 用洗涤液洗3 次, 每次15 min; BCIP/NBT显色液中显色数分钟, 待目标条带显色清晰时, 将NC膜转移到PBS 中停止显色, 拍照记录结果。 1.2.6 人脐血来源的巨核细胞CD41+培养 每份脐血均取自广东省造血干细胞库。选择年龄在2435 岁的足月妊娠健康产妇, 无肝炎、 结核等各种妊娠并发症, 样品经正式同意后来自足月分娩的胎儿。在无菌条件下采集样品, 脐血平均采集量为5080 mL, 4冰箱存放。免疫磁珠分离法体外分离脐血中CD34+细胞, 无血清液体培养体系中加入50 g/L TPO促进 CD41+巨核细胞生长, 37、 50 mL/L CO2条件下共同培养, 每34 d半量换液1 次, 培养8 d后收集CD41+细胞。 1.2.7 白血病巨核细胞系的培养 白血病巨核细胞系Dami、 Meg01均用含100 mL/L小牛血清DMEM培养基常规培养。细胞置于37孵箱中, 在50 mL/L CO2条件下培养。 1.2.8 hNudC蛋白在人巨核细胞的分布 培养收集人巨核细胞CD41+细胞, 调整细胞密度为1105个/L; 取细胞混悬液, 滴入经过L多聚赖氨酸处理后的玻璃载玻片上, 放入湿盒中孵育过夜贴壁, 用40 g/L多聚甲醛固定45 min; 与11 000稀释后的hNudC mAb孵育1 h; 然后与11 000稀释后的PE标记的二抗兔抗鼠IgG孵育1 h; 用PBS缓冲液5 min3次, 与11 000稀释后FITC标记的CD41 mAb孵育1 h; PBS缓冲液5 min3次, 与DNA核染料1 000 g/L DAPI, 4孵育1530 min。PBS缓冲液5 min3次, 封片, 在荧光显微镜下观察计数, Nikon COOL PIX4500数码相机摄影记录。 1.2.9 hNudC蛋白在白血病巨核细胞系的分布 Dami、 Meg01细胞培养、 收集、 固定等方法同1.2.8, 与11 000稀释后的hNudC mAb孵育1 h; 与11 000稀释后的FITC标记的二抗兔抗鼠IgG孵育1 h; 用PBS缓冲液5 min3次, 与DNA核染料1 000 g/L DAPI, 4孵育1530 min。PBS缓冲液5 min3次, 封片, 在荧光显微镜下观察计数, Nikon COOL PIX4500数码相机摄影记录。 1.2.10 hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达 收集对数生长期的人巨核细胞与Dami、 Meg01细胞株, 在500 L细胞裂解液（含Protease Inhibitor Cocktail）中快速匀浆。4抽提1.5 h, 4 12 000 r/min离心15 min, 吸取上清提取人巨核细胞与Dami、 Meg01细胞株的总蛋白分装-80冻存。制作蛋白质标准曲线, 测定所提取的蛋白浓度。使用Western blot 分析hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达, 每组样品均重复2次。 2 结果 2.1 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后, 共有84个微孔有杂交瘤细胞克隆生长, 其中有12个微孔能够检测到抗体, 经34次克隆化培养后, 获得2株（2C16和2D8）可稳定分泌抗 hNudC mAb的杂交瘤细胞。将其体外连续培养1个月后液氮冻存, 复苏后仍能稳定分泌抗 hNudC mAb。 2.2 mAb的特性鉴定 （1）效价测定: 杂交瘤细胞2C16和2D8培养上清中mAb的ELISA效价分别为164和132; 腹水mAb的效价分别为111105 和15104。（2）Ig亚类(型)鉴定: 采用Isotrip试剂盒对2株mAb 2C16和2D8的Ig亚类(型)进行鉴定, 结果表明二者分别为IgG1和IgM, 轻链均为型。 2.3 Western blot分析抗血清的特异性 用SDSPAGE和Western blot检测抗hNudC mAb对抗原的识别, 结果显示均在Mr 45 000处出现条带, 与重组表达hNudC的大肠杆菌的hNudC大小一致（图1）, 说明该抗体可以识别大肠杆菌重组表达的hNudC, 该抗体具有很高的特异性。 2.4 hNudC蛋白在人巨核细胞的表达 红色荧光标记的是hNudC, CD41FITC标记为绿色荧光的是人巨核细胞, 细胞核使用DAPI染色标记为蓝色荧光。可以看出, hNudC在人巨核细胞的大部分细胞膜上点状分布, 有些部位深, 有些部位浅; 胞质内的染色呈区域性（图2）。 2.5 hNudC 蛋白在巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami的表达 FITC标记为绿色荧光的是hNudC蛋白, 细胞核使用 DAPI 染色标记为蓝色荧光。hNudC在巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami大部分细胞膜上有不连续的线状着色, 胞质内的染色亦呈区域性（图3）。 2.6 hNudC蛋白在人巨核细胞和白血病巨核系细胞株中的表达 hNudC蛋白在Dami、 Meg01细胞株和人脐带血来源的巨核细胞中也有强的表达（图4）。 每组样品均重复2次都得到了相同的结果, 提示hNudC 蛋白特异性地表达于人的巨核细胞中。 3 讨论 巨核细胞增殖成熟过程是一个复杂的、 多阶段的细胞分化过程, 包括细胞分化、 增殖、 成熟, 最终产生血小板并释放进入血液循环。血小板生成素（thrombopoietin, TPO）是巨核细胞系的主要调控因子, 具有特异性刺激巨核细胞系祖细胞增殖与分化、 促进巨核细胞成熟、 提高外周血中血小板数目的作用6。但有研究认为血小板生成素TPO虽然在巨核细胞成熟过程中的早期具有非常重要的作用, 但是却对后期的血小板释放过程没有作用7。因此推测, 很可能存在有其它因子, 与TPO一起参与巨核细胞和血小板生成的调控过程。 许多研究表明hnudC基因在细胞增殖和正常的造血中起着重要的作用5。在正常人骨髓中的早期骨髓祖细胞和红系祖细胞中, hNudC 蛋白和mRNA都有高水平表达。另外, 与正常细胞水平比较, 从急性淋巴细胞性白血病(ALL)和急性骨髓白血病(AML)患者抽吸的骨髓中的hNudC显著增高了50倍, 表明hNUDC表达量的上调是白血病发生过程的一部分8。因此, hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用, 并与白血病的发生有关。 本课题组前期实验结果表明, hNUDC与TPO具有共同的受体, hNUDC可以特异地与血小板生成素受体（Myeloproliferative leykemia, Mpl）特异地结合, 而且发现hNUDC对于小鼠的巨核细胞系和血小板的生成, 具有与TPO类似的生物活性9, 因此初步表明hNUDC很有可能是巨核细胞增殖分化调控中一个重要的因子。 本研究使用重组人 hNudC 蛋白, 成功地建立了稳定分泌抗 hNudC mAb的杂交瘤细胞株。通过EL ISA、 Western blot 以及免疫荧光技术, 证明 hNudC的mAb效价高、 特异性好。利用制备的hNudC mAb, 采用免疫荧光技术, 检测了hNudC 蛋白在人巨核细胞中的表达情况和亚细胞定位, 显示hNudC 蛋白呈点状分布于人巨核细胞、 巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami的细胞膜与细胞核中, 这些结果为进一步探讨hNudC 蛋白在巨核细胞的增殖、 分化过程中的作用奠定了研究基础。因此, 抗hNudC mAb的成功制备对于深入研究 hNudC 蛋白的生物学效应, 寻找hNudC 相互作用的蛋白, 检测人体内 hNudC 各组织器官的分布、 生理和病理情况下的变化, 以及明确 hNudC 蛋白发挥效应的分子机制等研究具有重要意义。【参考文献】 1 Matsumoto N, Ledbetter DH. Molecular cloning and characterization of the human NUDC geneJ. Hum Genet, 1999, 104(6): 498-504. 2 Gocke CD, Osmani SA, Miller BA. The human homologue of the Aspergillus nuclear migration gene nudC is preferentially expressed in dividing cells and ciliated epitheliaJ. Histochem Cell Bioll, 2000, 114(4): 293-301. 3 Zhang MY, Huang NN, Clawson GA, et al. Involvement of the fungal nuclear migration gene nudC human homolog in cell proliferation and mitotic spindle formationJ. Exp Cell Res, 2002, 273(1): 73-84. 4 Gocke CD, Reaman GH, Stine C, et al. The nuclear migration gene NudC and human hematopoiesisJ. Leuk Lymphoma, 2000, 39(5-6): 447-454.5 Bruno S, Gunetti M, Gammaitoni L, et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and exvivo expanded cord blood cells: Rapid and transient megakaryocyte reconstitutionJ. Haematologica, 2003, 88 (4): 379-387.6 Bartley TD, Boge