人结肠癌组织中RUNX3的表达意义.doc

人结肠癌组织中RUNX3的表达意义作者：肖开提阿不都哈德尔迪力旦纳赛尔 【摘要】目的：探讨人结肠癌及远癌组织中RUNX3mRNA和RUNX3蛋白表达的临床病理意义.方法：用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分别检测50例手术切除的结肠癌组织及远癌组织中RUNX3mRNA的表达；用免疫组化方法（SP法）检测100例结肠癌及远癌组织中RUNX3蛋白的表达.结果：RUNX3mRNA和RUNX3蛋白在远癌组织中的表达明显高于结肠组织(0.280.05)vs（0.410.05）,P<0.01;58%vs100%,P<0.01.RUNX3蛋白的表达与癌细胞分化程度,淋巴结转移以及临床分期（Dukes分期）明显相关(U=144,P<0.01;2=15.11,P<0.01；2=11.02,P<0.05)与患者性别、年龄及肿瘤部位无关.结论：RNX3基因的表达异常与结肠癌的发生、发展密切相关. 【关键词】结肠肿瘤；runt相关转录因子3；转录聚合酶链反应；免疫组织化学 0引言 人RUNT相关转录因子3（humanruntrelatedtranscriptionfactor3,RUNX3）作为RUNT家族成员，参与胚胎发育过程中细胞基因表达调控.近年来研究发现，RUNX3基因可能在人类多种肿瘤的发病过程中起着重要的作用1.我们通过逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和免疫组织化学方法探讨结肠癌组织中RUNX3的表达及其与淋巴结转移、临床分期及癌细胞分化程度等的关系. 1材料和方法 1.1材料20001/200712手术切除病检确诊结肠腺癌50例，手术前均未接受放化疗.男27例，女23例，年龄3072(中位46.5)岁.取癌组织及距癌肿边缘10cm以上的远癌组织各1g，再分成两份，1份迅速置于液氮冷冻，-80低温冰箱保存；另1份置于40g/L甲醛液中固定. 1.2方法 1.2.1RUNX3mRNA的表达取冻存组织0.1g液氮中捣碎，转移到EP管中，加入Trizol试剂1mL，离心匀浆后经氯仿抽提，异丙醇沉淀出总RNA，溶于DEPC水中.通过紫外分光光度计测A值，计算样品总RNA浓度，并通过琼脂糖电泳检测其纯度.采用Promega公司RTPCR(A3500)两步法试剂盒，按操作说明进行，将RNA逆转录成cDNA.参照Zeng等方法设计引物，目的基因RUNX3的上游引物为：5TGGCAGGCAATGACG3，下游引物为：5CAGGGAACGGCTTGGT3，预计扩增片段为258bp.内参照actin上游引物为：5TTCCAGCCTTCCTTCCTGGG3，下游引物为：5TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT3，目标片段长度224bp.反应体系20L：去离子水13.8L,buffer(10)2L，dNTP(10mmol/L)0.5L，cDNA产物1L，目的基因及actin各自上下游引物各0.6L，Taq酶(83.35mkat/L)0.3L.循环条件为：94变性5min后，进行9430s，5140s，7240s的循环，循环30次后，72链延长10min，冷却至4.于15g/L琼脂糖电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察PCR条带.PCR扩增产物紫外灯下成相后经光密度扫描仪扫描定量，用genetools软件计算CDX2/actin条带的A比值表示RUNX3mRNA的相对表达水平. 1.2.2RUNX3蛋白的表达石蜡包埋标本，4m连续切片.SP免疫组化染色试剂盒购自深圳晶美生物技术有限公司，一抗为兔抗人RUNX3mAb，工作浓度为1100；二抗为羊抗兔IgG(均购自深圳晶美公司).阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗.RUNX3蛋白免疫组化染色定位于细胞核，阳性染色呈棕黄色.结果由一名病理科医师采用盲法判断.按照四级分法,即阳性细胞数25%为(+),26%50%为(),>50%为(),无阳性细胞(-)；再结合染色强度,浅黄色为(+),棕黄色(),棕褐色为(),无着色细胞为(-）；两者合二为一，分成强阳性(),阳性()，弱阳性(+)，阴性(-)进行分析判断. 统计学处理：RUNX3mRNA相对表达量用xs表示，采用t检验分析组间差异.RUNX3蛋白表达采用非参数检验，采用SPSS12.0统计软件完成，检验水准0.05. 2结果 2.1RUNX3mRNA的表达癌组织及远癌组织中RUNX3mRNA都有表达，癌水平显著低于癌旁正常组织(0.280.05)vs(0.410.05),P<0.01,图1，表1. 1:maker；2:癌组织；3:癌旁正常组织. 图1结肠癌与远癌标本RUNX3mRNA表达 2.2RUNX3蛋白阳性表达结肠癌标本中表达率58%，其中（）19例（38%），()10例（20%）；在远癌组织中RUNX3蛋白均为阳性，其中(+)7例,（）29例,（）14例，两组之间存在统计学差异（P<0.01,图2）.RUNX3蛋白在人结肠癌中的表达与年龄、性别及肿瘤部位无关（P>0.05），与淋巴结转移、Dukes分期、癌细胞分化程度有关（P<0.05,表1）.表1结肠癌组织RUNX3蛋白表达与临床病理的关系 3讨论 本研究表明在人结肠癌手术切除标本中RUNX3表达下调，并且癌细胞分化程度越低，有淋巴结转移，Dukes分期越晚，RUNX3表达越低，我们推测结肠癌的发生及发展与RUNX3下调有关.国外研究表明RUNX3蛋白是TGF信号通路下游的一个转录因子，可能是TGF信号传导通路的靶点1-2.我们认为RUNX3基因的表达下调甚至缺失使TGF/Smad信号传导通路紊乱，很可能是结肠癌发生、发展过程中的重要一环. RUNX3基因下调表达的机制目前认为可能与基因缺失和甲基化有关2-5.肿瘤细胞中RUNX3基因启动区CpG岛的甲基化是RUNX3基因失活的主要原因.在非肿瘤细胞中RUNX3基因CpG岛的甲基化率很低，且与老年有关6-8.结合本研究我们认为推断RUNX3可能作为诊断结肠癌的生物学指标，且对于临床判断结肠癌的恶性程度、临床分期、转移以及术后复发有重要的参考价值. 在不表达RUNX3的肿瘤细胞系中加入DNA甲基转移酶抑制剂5氮杂2脱氧胞苷（5aza2deoxycytidine,AZA）和/或组蛋白乙酰基转移酶抑制剂（trichostatinA,TSA）后出现了RUNX3的表达5,7，因此，我们认为如果能促进结肠癌细胞中RUNX3表达和转录，就有可能抑制肿瘤细胞生长、转移，降低临床分期，从而为晚期结肠癌患者创造手术条件，提高结肠癌的疗效. 【参考文献】 1LiQL,ItoK,SakakuraC,etal.CausalrelationshipbetweenthelossofRUNX3expressionandgastriccancerJ.Cell,2002,109(1):113-124. 2ZaidiSK,SullivanAJ,vanWijnenAJ,etal.IntegrationofRunxandSmadregulatorysignalsattranscripttionallyactivesubnuclearsitesJ.ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(12):8048-8053. 3TozawaT,TamuraG,HondaT,etal.PromoterhypermethylationofDAPkinaseisassociatedwithpoorsurvivalinprimarybiliarytractcarcinomapatientsJ.CancerSci,2004,95(9):736-740. 4MiyazonoK,SuzukiH,ImamuraT,etal.RegulationofTGFbetasignalinganditsrolesinprogressionoftumorsJ.CancerSci,2003,94(3):230-234. 5WadaM,YazumiS,TakaishiS,etal.FrequentlossofRUNX3geneexpressioninhumanbileductandpancreaticcancercelllinesJ.Oncogene,2004,23(13):2401-2407. 6WakiT,TamuraG,SatoM,etal.PromotermethylationstatusofDAPkinaseandRUNX3geneinneoplasticandnonneoplasticgastricepitheliaJ.CancerSci,2003,94(4):360-364. 7GuoWH,WengLQ,ItoK,etal.Inhibitionofgrowthofmousegastriccancercellby