先天性心脏病合并肺动脉高压一氧化氮合酶mRNA表达及临床意义.doc

先天性心脏病合并肺动脉高压一氧化氮合酶mRNA表达及临床意义 作者：封加涛，苏艳玲，龚光甫，胡冬煦，曹亚 【关键词】 心脏缺损,先天性；高血压,肺性；一氧化氮合酶；RNA,信使 【Abstract】 AIM: To explore the pathophysiological significance of nitric oxide(NO) and nitric oxide synthase(NOS) in congenital heart defects with pulmonary hypertension. METHODS: Twentyfour patients with congenital heart defects were divided into 3 groups: mild pulmonary hypertension group(n=8), moderate or severe pulmonary hypertension group(n=9), and nonpulmonary hypertension group(n=7). NOS mRNA expression was detected in lung tissues with reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR). RESULTS: The NOS mRNA expression levels in the patients with moderate or severe pulmonary hypertension were much lower than those in the ones with mildpulmonary hypertension or nonpulmonary hypertension (P<0.05). There was an inverse correlation between the NOS mRNA expression level and the pulmonary arteriopathy in the patients with pulmonary hypertension (r=-0.833, P<0.01). CONCLUSION: In patients with congenital heart defects associated with pulmonary hypertension, NO and NOS play a role in pathological process of pulmonary arteriopathy, and the NOS mRNA expression level was proportional to the severity of pulmonary hypertension or pulmonary arteriopathy. 【Keywords】 heart defects, congenital; hypertension, pulmonary; nitric oxide synthase; RNA, messenger 【摘要】 目的： 了解一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）在先天性心脏病合并肺动脉高压中的病理生理作用. 方法： 将24例左向右分流先天性心脏病患者分为三组：轻度肺动脉高压8例，中重度肺动脉高压9例和无肺动脉高压7例,应用逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）检测患者肺组织中NOS mRNA的表达. 结果: NOS mRNA表达水平在中重度肺高压组较轻度肺高压组和无肺高压组显著减低（P<0.05）；NOS mRNA表达与肺高压肺血管病变程度呈负相关（r=-0.833, P<0.01）. 结论: NOS, NO 参与先天性心脏病合并肺动脉高压肺血管病变的病理过程;肺组织NOS mRNA的表达， 随肺动脉高压和肺血管病变程度的加重而下降. 【关键词】 心脏缺损，先天性；高血压，肺性；一氧化氮合酶；RNA，信使 左向右分流先天性心脏病，常合并肺动脉高压，其病理特征为渐进性肺血管病变，病变严重程度影响患者的预后， 然而这些肺血管病变发生的机制尚未完全明了. 研究表明，先天性心脏病引起的肺动脉高压,于病变早期即有肺血管内皮细胞超微结构的改变，而血管内皮细胞在合成、释放多种生物活性物质以调节血管张力，抑制平滑肌细胞增生，维持肺循环的低张、低压状态1，在延缓肺血管病变的进展方面有重要意义. 其中， 具有多种生理功能的细胞内信息分子一氧化氮（nitric oxide，NO）尤为重要2. NO极不稳定,随着一氧化氮合成的限速酶一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）基因的克隆成功2. 为从分子生物学水平研究NO的病理生理作用提供了重要手段. 为此，我们采用现代分子生物学技术，观察先天性心脏病合并肺动脉高压患者肺组织标本中NOS mRNA 表达情况及其与肺动脉高压严重程度的关系，为阐明NO在先天性心脏病肺动脉高压病理生理中的作用提供理论依据. 1对象和方法 1.1对象胸心外科住院病例24(男14,女10). 年龄217岁. 经病史、体查、一般化验、胸部正侧位X线片、心电图、彩超等检查. 全部为先天性心脏病，17例并肺动脉高压,其中室间隔缺损19例，室间隔缺损主动脉窦瘤破裂1例，室间隔缺损房间隔缺损1例，室间隔缺损动脉导管未闭1例，房间隔缺损2例. 全部患者都在体外循环下进行手术. 术中在体外循环建立前测量肺动脉压力(PAP)，根据测压将24例病例分为无肺高压组、轻度肺高压组、中重度肺高压组三组，其中例平均肺动脉压(MPAP)为(17.32.4) mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)确定为无肺高压组. 17例平均肺动脉压均超过， 超过国内目前使用的肺动脉高压的诊断标准值（肺动脉平均压大于20 mmHg），并结合临床资料有肺动脉高压表现（如临床听诊P2亢进， 胸片示肺动脉段突出，心电图示双室或右室肥大），认定术前合并肺动脉高压；其中，9例术中测压MPAP为(53.29.7) mmHg，肺动脉收缩压(SPAP)与体循环动脉收缩压(SAP)之比为0.760.10，确定为中重度肺动脉高压组4；8例术中测压MPAP为(24.43.3) mmHg, SPAP/SAP为0.360.15，确定为轻度肺动脉高压组4. 所有受试者均无糖尿病、心肌梗死、肾功能不全和原发性肺动脉高压等病史，未曾使用硝脂类等特殊药物. 三组间年龄、性别、血红蛋白(Hb)、血氧饱和度(SaO2)，均无显著性差别. Taq DNA聚合酶和dNTPs购自美国生命技术公司，AMV Reverse Transcription Kit,Pgem7ZF(+)/HaeIII购自Promega公司. NOSmRNA, 2MG mRNA引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成. NOS mRNA的引物序列3（5引物：GGTGAATCCATACCAGCCTGATCCATGGAACAC, 3引物：TACTCGAAACGCCTGTCCTTCTTCTTCGAATGG）. 2MG mRNA引物序列(5引物：CTCCAAAGATTCAGGTTTAC， 3引物：ATCTTCAAACCTCCATGATG). 1.2方法 1.2.1组织标本的获取和保存于右肺上叶取一肺组织块约3 cm2 cm1 cm大小. 采取的组织块放入经处理后的冻存管内(分装)，立即置液氮中速冻，然后置于-70保存，以备提取组织总RNA和冰冻切片用. 1.2.2肺组织血管的病理学分级肺组织切片，固定，HE染色，然后进行显微镜观察. 1.2.3NOS mRNA的RTPCR半定量检测用Trizol试剂盒抽提RNA，A值在1.82.0之间, 1 g RNA经反转录后取1/8体积5 L反应液进行PCR, 条件为94 1 min，55引物退火2 min，72延伸3 min，共进行35个周期. 首次循环前先在94变性2 min，最后一次循环后在72延伸10 min. NOS和2MG 在同一管内扩增，取10 L PCR产物在2 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳、照相. 以图像分析系统对电泳结果照片上NOS,2MG特异性扩增产物的电泳带密度扫描定量，然后计算出NOS和2MG密度之比值，确定NOS mRNA的相对表达水平. 统计学处理： 用SPSS6.0统计软件包作统计处理，实验数据用xs表示. 先进行三组间方差齐性检验，在方差齐的基础上作方差分析，若有显著差异，则进一步做三组间两两比较的q检验；对NOS mRNA表达与病理分级进行相关分析,如方差不齐采用秩和检验,P<0.05为有统计学差异. 2结果 2.1肺组织血管的病理学分级17例肺高压患者肺组织血管病理改变程度参照 Healthy等3的病理分级标准，其中血管形态正常5例，1级改变6例，2级改变4例，3级改变2例. 组织学变化在肌型动脉和细动脉较弹力型动脉明显. 中重度肺高压病例的肺血管改变也明显比轻度肺高压病例的改变重. 2.2RTPCR检测用RTPCR方法检测无肺高压组、轻度肺高压组、中重度肺高压组肺组织标本中NOS mRNA相对表达水平，电泳结果见图1. 中重度肺动脉高压组NOS mRNA表达水平较非肺高压组和轻度肺高压组NOS mRNA表达显著降低（P<0.05），轻度肺高压组与非肺高压组NOS mRNA表达水平无差别(0.860.04) vs (0.920.03, P>0.05. 1,16: 标记物; 68: 轻度肺高压样本; 25: 无肺高压样本; 912: 中重度肺高压样本; 13: 内参照; 14: 样本; 15: 阴性对照物. 图1RTPCR电泳结果 2.3肺高压组肺组织NOS mRNA表达与肺血管病理分级的相关分析结果显示肺组织NOS mRNA表达水平与肺血管病理分级呈明显负相关（r=-0.833, P<0.01）. 3讨论 本研究采用RTPCR分子生物学技术，检测先天性心脏病无肺高压、轻度肺高压和中重度肺高压患者肺组织标本中NOS mRNA的表达，结果表明，NOS mRNA表达水平与肺动脉高压的严重程度密切相关， 即肺高压程度越重， 肺血管病变越重，NOS mRNA表达下降越明显. 中重度肺高压患者NOS mRNA表达较无肺高压和轻度肺高压患者明显减低(P<0.05)， 而在轻度肺高压患者中NOS mRNA表达下降不明显(P>0.05)，说明NOS mRNA表达下降是继发于肺血管内皮细胞受损之后，且可能参与肺动脉高压的发生、发展过程. 无肺高压者，在肺血流量增多时，由于血管壁切变应力增加，可剌激肺血管内皮细胞分泌NO4， 以扩张肺血管适应血流动力学的变化，即机体处于一种代偿状态. 但切变应力、高动力循环本身，特别是涡流及涡流切变应力对血管内皮有损伤作用5 ， 不引起NOS mRNA表达增加，或不引起NO释放增加. 故随病程进展，一旦这种代偿机制受损，则表现为肺动脉高压状态，并随肺血管病变的严重程度而加重. 本研究表明，中重度肺高压NOS mRNA 表达水平显著降低，而轻度肺高压时NOS mRNA表达下降不明显. Nakamura等6发现，先天性心脏病于肺高压前期(有肺血增多，但无肺高压)，乙酰胆碱舒张血管的作用消失， 而保留硝普钠对血管的舒张作用， 即乙酰胆碱不能再增加NO的分泌，当出现肺血管病变时，对硝普钠和乙酰胆碱的舒张作用显著减弱，因此认为这种早期舒张功能受损是肺血管病变的一个重要特征. Villanueva等7通过检测新生儿持续肺高压患儿肺组织NOS mRNA,其表达下降. 本研究与此结果相符. 另有研究应用外源性NO吸入治疗急、慢性肺动脉高压，取得良好效果8， 也支持在肺高压时内源性NO合成减少或相对不足. 先天性心脏病合并肺动脉高压NOS mRNA 表达减低的原因： 肺血流量增多，血管壁切变应力增加，特别是涡流损伤了血管内皮细胞的形态和功能，即内皮受损后继发引起NOS mRNA表达下降； 内皮受损，合成分泌NO减少，失去对肺血管的舒张保护调节，血管收缩因子的作用增加，加重血管功能的损害，进一步减少NOS mRNA 表达. NOS mRNA表达减低或相对不足的后果： 由于NO 合成分泌减少，血管舒张功能受损,对内皮的保护作用亦受损,且受损的肺血管对缩血管物质特别敏感，如NO不仅可对抗内皮素的收缩血管作用，且抑制它的释放；NO减少，使NO对内皮素的抑制减少，从而导致肺小动脉收缩. NO能抑制细胞的有丝分裂，从而抑制血管平滑肌细胞的增生. 肺高压时表现为血浆内皮素增多，肺血管内皮素1 mRNA表达增加，而内皮素可促进平滑肌细胞的增生. 这一对重要的舒张和收缩因子失衡，使NO不能有效拮抗内皮素收缩血管和促进平滑肌细胞增生的效应10，结果血管收缩，血管腔变窄，外周阻力增大；而肺高压又进一步加重内皮细胞受损，形成恶性循环，使肺高压进一步加重，即NO在肺高压患者肺血管的构建中起重要作用. NO减少，使NO抑制血小板及白细胞在肺内聚集和黏附的功能受损，血小板及白细胞更易黏附于损伤的内皮细胞上，形成血栓； 并激活血小板释放血栓素A2(TXA2)等收缩因子，血栓栓塞将导致肺小动脉闭塞或数目减少，肺血管阻力增加，更加重肺动脉高压9. 本结果给我们以下启示: 先天性心脏病肺动脉高压一旦形成，是肺循环失代偿的表现，NO分泌不足，将加快肺动脉高压的进程，故宜早期手术. 可利用外源性NO 类药物治疗先天性心脏病合并肺动脉高压，特别是内源性NO药物的开发和应用，有可能延缓肺动脉高压的进程. 【参考文献】 1 Haworth SG. Pulmonary hypertension in the youngJ. Heart, 2002,88(6):658-664. 2 Black SM, Bekker JM, McMullan DM, et al. Alterations in nitric oxide production in 8weekold lambs with increased pulmonary blood flowJ. Pediatr Res, 2002,52(2):233-244. 3 Healthy D, Edward JE. The pathology of hypertensive pulmonary vascular disease: A description of six grades of six grades of structural changes in the pulmonary arteries with special reference to congenital cardiac septal defectsJ. Circulation, 1958,18:533. 4 Ikemoto Y, Teraguchi M, Kobayaski Y, et al. Plasma levels of nitrate in congenital heart disease: Comparision with healthy children J. Pediatr Cardiol, 2002,23(2):132-136. 5 Chou TF,Wu MS, Chien CT, et al. Enhanced expression of nitric oxide synthase in the early stage after increased pulmonary blood flow in ratsJ. Eur J Cardiothorac Surg, 2002,21(2):331-336. 6 Nakamura M,Yoshida H, Nag