再障病人T细胞群及HLADR抗原表达的测试和分析.doc

再障病人T细胞群及HLA-DR抗原表达的测试和分析【摘要】 目的 测试再障（AA）病人外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+和HLA-DR抗原的表达，探索再障发病机制。方法 用免疫组化斑点印迹技术测试，以薄层扫描仪对所有斑点印迹记号，做扫描。结果 再障病人CD4+降低，CD8+升高，CD4+/D8+比值颠倒，HLA-DR表达抬高。结论 T 淋巴细胞亚群比例失衡、HLA-DR抬高，至少参与了大多数病人的发病过程。 【关键词】 AA T细胞亚群 HLA-DR抗原 再生障碍性贫血（Aplastic Anemia ,AA）（简称再障）是指因获得性骨髓功能衰竭，造成全血细胞减少的一种疾病，临床上以红细胞、粒细胞和血小板减少所致的贫血,感染和出血为其特征。AA发生的机制尚未完全阐明。现有的证据表明，再障的发病机制，呈明显异质性和重叠性的特征1。研究发现，大约半数病人T细胞亚群分布失常。不少试验显示，外周血和骨髓T细胞克隆性增生，或是淋巴细胞亚群功能异常等过程，参与了这一种疾病的发病机制。我院于2006年1月至2010年3月，对住院的该病种病人，采用免疫组化斑点印迹技术测试，为进一步探讨AA发病的免疫机制，做了一点探讨。现将测试方法、结果及其分析，作文报道如下。 1 资料和方法 1.1研究对象 将研究对象72例，全为慢性AA，分成各36例的两个组。一为试验组，一为对照组。试验组36例：其中男21例，女15例。年龄1758岁，平均28.3岁。对照组36例：其中男20例，女16例，年龄19-60岁，平均29.3岁，两组病程分别为2.3年、2.5年，两组性别、年龄及病程，经比较，无统计学意义（p0.05），具有可比性。 1.2制作标本 晨空腹采取时肘静脉血5ml，肝素抗凝，采用Ficoll常规无菌分离，收集单个核细胞，用含小牛血清的RPM11640培养液，把它稀释成2106个/ml的细胞悬液，制成滴片与滴膜，在室温下晾干，-20冷藏备检。 1.3试验试剂 HLA-DR单抗选用华美公司生产的。免抗鼠-硷性磷酸酶标记，选用华美公司的。CD4+、CD8+单抗，选用北京军事医学科学院基础医学研究所的产品。 1.4检测过程 滴膜，首先以氯仿蒸气熏蒸2分钟。破膜后，对他们诊断AA的标准,符合1987年第四届平障学术会议修定的标准2 。把滴膜放入增养孔内，加CD4+、CD8+或HLA-DR单抗，4条件下14小时到18小时，取出后冲洗，再加亚抗-免抗鼠硷性磷酸酶标记，37中置半小时到1小时，TBS-HCI依次冲洗，再以四唑盐及5-溴4-氯3-吲哚磷酸为底物。37孵育显色。同时，作不加底物或不加工抗的对照。对所有斑点印迹记号进行薄层扫描。 1.5统计处理 计数用x-s，比较用T检验，P0.001，为有统计学意义。 2 结果 两组病人T细胞亚群和HLA-DR抗原表达比较（x-s） 3 讨论 3.1在AA的发病机理中，研究者发现，T淋巴细胞亚群是机体免疫系统中，主要的调节因子。T细胞亚群分布异常，辅助T细胞/抑制T细胞（CD4+/CD8+）比值颠倒。去除T细胞后，体外培养可以见到细胞集群增加。已经有确凿的证据证明，AA病人有T细胞的异常激活，T细胞产生的造血抑制因子（如造血员调节因子等）如干扰素、白介素2和肿瘤坏死因子-a的水平增高。同时研究还发现，AA病人产生造血抑制因子的Th1细胞的比例抬高，但Th2细胞则没有增高或降低。加之，免疫抑制治疗再障，效果是肯定的。这说明AA 病人免疫功能，特别是细胞免疫功能出了问题。骨髓已被当作一个靶器官，遭到了免疫损伤，这是AA发病机制中不可或缺的一环。不过，对于异常免疫功击的始动因素，造血细胞的受击靶点定位，目前尚不明了。 3.2本试验结果显示，AA 病人CD4+细胞数降低，CD8+细胞的总数都上抬，细胞间的比值发生颠倒。这一结果表示，AA 病人身体中存在着T淋巴细胞亚群严重的比例失调。淋巴细胞的表面抗原HLA-DR表达明显增变，且CD8+细胞数增加伴同HLA-DR抗原表达增加的，占AA 病人中的大多数，这与Hsu的报道一致3 ，这充分说明，CD8+细胞不仅通过细胞毒作用直接抑制骨髓造血干、组细胞的分裂、增殖，CD8+细胞还可释放IFN-r、TNF-a等因子，抑制单核巨噬细胞，产生造血负性调节因子，从而间接抑制造血。HLA-DR抗原表达抬高，证明HLA-DR和它的亚型对AA发病，具有明确的易感性。可见，本试验结果和临床免疫抑制剂治疗的效果，显示T淋巴细胞亚群功能失调分导的造血抑制，和HLA-DR抗原表达抬高，参与了AA的发病机制。值得注意的是，有少数AA病人，T淋巴细胞亚群的比例，并未出现异常，他们用免疫抑制治疗的效果也不好。可见AA发病的多元说是不能绝对否定的4。 参 考 文 献 1王吉耀，主编，内科学M北京.人民卫生出版社，2009：709. 2再生障碍性贫血诊断标准和疗效标准S，中华血液学杂志，1987，8（8）：封4. 3Hsu HC,Tsai WH,Chee LY at al.Production of hematopoietie regulat