卵巢上皮性癌组织APE1和P53的表达及其耐药性.docVIP

卵巢上皮性癌组织APE1和P53的表达及其耐药性 作者：张颖，王建，辛晓燕，王东，向德兵，林莉 【摘要】 目的： 探讨脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶（APE1）基因和P53在卵巢上皮性癌中的表达相关性，探讨两者与卵巢癌化疗耐药的相关性. 方法： 应用免疫组织化学法对原发性卵巢癌组织120例中脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶（APE1）和P53表达状况进行测定. 结果： P53表达与APE1表达强度和亚细胞定位无相关性（P0.05）. APE1/p53不同表达状态的卵巢癌组织对铂类为基础的化疗敏感性有统计学差异(P0.05). 结论：APE1和P53在铂类的耐药性产生过程中发挥重要作用，对预测化疗药物敏感性具有一定的临床指导价值. 【关键词】 卵巢肿瘤 脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶 基因 p53 DNA修复【Abstract】 AIM: To investigate the correlation between p53 and apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) gene expressions in epithelial ovarian carcinoma and their roles in the chemoresistance of ovarian carcinoma. METHODS: The expressions of APE1 and p53 in 120 cases of primary ovarian carcinoma were determined using immunohistochemistryThe relationship between the expression of APE1 and clinical pathological features was analyzed. All the patients did not receive chemotherapy or radiotherapy before operation. RESULTS: All epithelial ovarian carcinomas expressed APE1.P53 gene immunoreactivity in epithelial ovarian carcinomas was present by 50.8%. The location status of APE1/p53 was significantly correlated with platinum-based chemotherapy sensitivity (P0.05)CONCLUSION: APE1 and p53 play important roles in the drug-resistance of ovarian carcinoma to platinum-based chemotherapy,so they may be used as the indicators of the chemotherapy sensitivity.【Keywords】 ovarian neoplasms；apurinic/apyrimidinic endonuclease；genes,p53；DNA repair0 引言 卵巢癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一，耐药是导致其化疗失败的主要原因. 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)具有DNA损伤修复及氧化还原双重功能，是一种多功能蛋白，对维持DNA的稳定和调节细胞因子的表达具有重要作用. 研究表明，APE1和卵巢癌以铂类为基础的化疗疗效和化疗耐药有相关性；此外，p53蛋白的状态是也决定卵巢癌耐药性的重要因素之一1. 因此，我们采用免疫组化SP法检测卵巢癌中APE1和P53的表达相关性，分析他们与临床化疗疗效及病理指标间的关系.1 材料和方法1.1 材料 标本：取自第四军医大学西京医院和第三军医大学大坪医院1998-01/2007-03经手术确诊的卵巢癌初治患者120例，年龄1981（平均47.2）岁. 其中浆液性囊腺癌54例，粘液性囊腺癌35例，子宫内膜样癌7例,未分化腺癌24例；细胞学分级中高分化癌19例，中分化癌68例，低分化癌33例. 按国际妇产科联盟（FIGO)2003年手术病理分期标准，I期23例、期11例、期73例、期13例. 术后均给予铂类为基础的联合化疗后随访78例，失访24例，随访率65.0%，失访病例截止日期取病例末次住院的出院日期. 试剂：浓缩型APE兔抗人mAb购自Novus Biologicals公司，工作浓度为15000；SP免疫组化试剂盒Power VisionTM(IgG抗体-HRP多聚体)和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司.1.2 方法 所有组织标本均经甲醛固定，石蜡包埋，切片厚5 m，分别行HE染色核实诊断和SP二步法免疫组化染色. 以PBS替代一抗作为阴性对照，已知APE1阳性的骨肉瘤标本作为阳性对照. 免疫化学分析采用二步法，二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，30 mL/LH2O2一甲醇室温10 min，微波抗原修复，滴加一抗，4过夜，37孵育30 min，DAB-H2O2显色，苏木素复染. 采用磷酸盐缓冲液代替一抗作为免疫染色阴性对照，采用已知APE阳性的骨肉瘤标本作为阳性对照. 将5 m石蜡切片脱蜡水化后,分别行HE染色核实诊断和SP二步法免疫组化染色. 二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，30 mL /LH2O2一甲醇室温10 min，微波抗原修复，滴加一抗，4过夜，37孵育30min，DAB-H202显色，苏木素复染. 阴性对照用PBS代替一抗，已知阳性骨肉瘤组织切片作阳性对照. 光学显微镜镜下观察，免疫阳性信号为棕黄色细小颗粒. 参照文献采用半定量积分法，即对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度进行分级计分，然后根据两项之和确定其阳性强度. 0分为阴性，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳性. 阳性细胞率即阳性细胞占计数细胞的比例，以随机计数10个高倍视野细胞为准，阳性细胞75为4分，两项之和13分为弱阳性，35分为中度阳性，57分为强阳性. 统计学处理：采用SPSS13.0软件，对计数资料应用2检验，对等级资料进行秩和检验. P0.05）；P53阴性表达时，APE1核表达为42例（71.2%），而P53阳性表达时，APE1核表达为39例（63.8%），但P53表达强度与APE1表达定位无相关性（P0.05）.2.2 APE1和P53表达与卵巢癌病理特征的关系 APE1和P53蛋白在卵巢癌中的表达与卵巢癌组织细胞分化程度、临床分期显著相关. 早期（期+期）卵巢癌中APE1和P53蛋白表达均低于晚期（期+期）卵巢癌，APE1和P53蛋白随着细胞分化程度的降低表达均逐渐增强. 有淋巴结转移组中P53蛋白表达显著高于无淋巴结转移组(P0.05). APE1蛋白表达与淋巴结转移无统计学相关(表1).2.3 APE1亚细胞定位/p53表达状态与对铂类为基础的化疗敏感性的关系 卵巢癌患者根据GOG(美国妇科肿瘤学组)建议的分型，化疗敏感性卵巢癌定义为：初次采用以铂类药物为基础的化疗并获得临床证实的缓解，停药超过6 mo才出现复发灶；耐药性卵巢癌定义为：初次治疗有效，但在完成化疗相对较短的时间，即6 mo内复发，应考虑为对铂类耐药. 共有78例卵巢癌患者完成了至少6个周期以铂类为基础的规范性化疗. 将其分为铂类敏感组和铂类耐药组，分别统计敏感组和耐药组中APE1亚细胞定位/p53表达状态. APE1和p53蛋白在卵巢癌组织内呈四种表达状态：单纯核表达/p53 (41.0%，32/78)、单纯核表达/p53(29.5%，23/78)，异位表达/p53(15.4%，12/78)、异位表达/p53(14.1%，11/78). APE1/p53不同表达状态的卵巢癌组织，对铂类为基础的化疗敏感性有统计学差异(P0.05)，11例APE1异位表达/p53-的卵巢癌有8例出现耐药（72.7%）(表2).表1 APE1和P53表达与卵巢癌病理特征的关系（略）aP0.05 vs 组内.表2 APE1亚细胞定位/p53表达状态与对铂类为基础的化疗敏感性的关系（略）2=9.51，P=0.02.3 讨论 卵巢上皮性癌占卵巢恶性肿瘤60%70%，DNA修复是导致低水平DDP耐药的主要原因. APE是一个具有强大功能的生物分子，也是唯一修复DNA AP位点的双功能酶，它同时具有AP核酸内切酶和3磷酸二酯酶的活性,可以修复细胞内大量存在的嘌呤嘧啶缺失位点，降低细胞凋亡、微卫星不稳定性或基因突变的发生机率2. APE1还通过氧化还原调控多种关键转录因子，参与氧化应激、细胞周期控制与凋亡等重要细胞反应. APE1基因敲除小鼠在胚胎期即死亡，表明APE1是决定细胞存活的关键基因. 近年来，APE1与化疗药物敏感性的关系逐步受到重视，Wang等3最早利用合成的APE1特异性siRNA转染骨肉瘤细胞株HOS，有效地增加骨肉瘤细胞对DNA损伤药物的敏感性. 新近McNeill等4应用显性负突变体抑制APE1的表达，在CHO细胞的研究中发现可以显著增强典型的DNA损伤药物的细胞毒效应，其中MMS可以增强5.4倍. APE1 siRNA可显著增强多发性骨髓瘤细胞对马法兰的敏感性5. 对于APE1与肿瘤治疗敏感性之间关系的机制研究认为，常规肿瘤治疗手段可以直接损伤肿瘤细胞的DNA杀伤肿瘤细胞，此外还通过多种途径产生大量ROS使肿瘤细胞处于氧化应激状态，通过形成氧化性DNA损伤和调控基因表达促进细胞凋亡起到肿瘤杀伤效应，而APE1在在这一过程中发挥着重要的作用6. 在以损伤细胞DNA为目的的肿瘤治疗中，DNA损伤修复可能是肿瘤细胞对治疗不敏感的重要机制7. APE1在DNA损伤修复的BER途径中发挥着限速酶的作用，其活性直接决定细胞对氧化性DNA损伤的修复能力，实验发现缺乏AP内切酶Apn1（为APE1在酵母菌中的同源蛋白酶）的酵母菌对5-FU的治疗反应明显增强8. 本研究显示，在卵巢癌组织中，APE1表达强度与FIGO分期、细胞分化程度有相关性. 并且APE1的亚细胞定位呈胞核表达、单纯胞质表达或核质共同表达，且其异位染色较胞核染色显著，胞核染色强弱不等. APE1细胞质表达与肿瘤恶性程度有关，高分化的卵巢癌细胞质表达少见. APE1表达定位的改变以及表达强度的变化很可能是细胞表型异常的决定因素. 研究表明，P53基因在卵巢癌铂类耐药中发挥重要作用. P53基因在DNA损伤后的修复和细胞增殖中起重要作用，其突变引起的P53蛋白功能丧失是肿瘤细胞耐药的原因之一. 此外，P53突变引起细胞凋亡调控失败，从而导致卵巢癌对顺铂耐药是P53参与耐药形成的另一机制. 本研究结果显示APE1/p53不同表达状态的卵巢癌组织，对铂类为基础的化疗敏感性有统计学差异(P0.05)，11例APE1异位表达/p53-的卵巢癌有72.7%出现耐药. 这一结果提示，APE1可能在P53参与的DNA修复过程中存在着某种调控机制. 我们推测，在卵巢癌组织中虽然APE1表达与p53突变没有相关性，但由于卵巢癌组织内APE1表达上调，导致其DNA修复能力提高；而同时由于肿瘤内p53基因突变，致使APE1的促凋亡路径之一的主要转录因子-野生型p53基因缺失，从而使其抑凋亡能力受到抑制. 这可能是卵巢癌化疗耐药产生的机制之一. 综上所述，APE1和P53表达与铂类耐药关系密切，其在卵巢癌组织中的表达，对预测化疗药物敏感性和判断化疗疗效具有一定的临床指导价值.【参考文献】 1 Pommier Y，Sordet 0，Antony S，et a1 Apoptosis defects and chemotherapy resistance：molecular interaction maps and networksJOncogene,2004,23(16)：2934.2Misra RR，Ratnasinghe D，Tangrea JA,et al. Polymorphisms in the DNA repair genes XPD，XRCC1，XRCC3，and APE/ref-1，and the risk of lung cancer among male smokers in FinlandJ. Cancer Lett，2003，191(2):171-178.3Wang D,Luo M,Kelley MR. Human apurinic endonuclease 1 (APE1) expression and prognostic significance in osteosarcoma: enhanced sensitivity of osteosarcoma to DNA damaging agents using silencing RNA APE1 expression inhibitionJ. Mol Cancer Ther,2004,3(6): 679-686.4McNeill DR,Wilson DM 3rd. A dominant-negative form of the major human abasic endonuclease enhances cellular sensitivity to laboratory and clinical DNA-damaging agentsJ. Mol Cancer Res,2007,5(1):61-70.5Yang ZZ,Chen XH,Wang D.