唾液富组蛋白5表达载体的构建.doc

唾液富组蛋白5表达载体的构建【摘要】 目的 将唾液富组蛋白5 cDNA克隆至表达载体pGEX4T1。方法 EcoR+ Sal双酶切克隆载体pMD19Thrp5及pGEX4T1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX4T1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果 唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX4T1，无突变。 结论 重组载体pGEX4T1hrp5构建成功。 【关键词】 唾液富组蛋白5 克隆 表达载体 Construction of Expression Vector of Salivary Histatin 5 ZHOU Qi，JIN Kehua，LUO Desheng，et al (Students of Grade 2004, Xianning University Medical School，Xianning Hubei 437100，China) ABSTRACT：Objective To clone the cDNA of salivary histatin 5 to expression vector pGEX4T1.Methods pMD19Thrp5 and pGEX4T1 were digested by Sal+ EcoR.The digested hrp5 and pGEX4T1 were linked and transformed to E.coli DH5，and the positive colonies were screened by ampicillin, and identified by PCR，digestion and sequencing. Results The cDNA of hitatin 5 was correctly inserted into expression vector pGEX4T1 without mutation. Conclusion Recombinant vector pGEX4T1hrp5 was constructed successfully. KEY WORDS:Salivavry Histatin 5；Clone；Expression vector 唾液富组蛋白5（HRP5）为富含组氨酸的阳离子多肽，存在于人类和灵长类动物腮腺唾液分泌物中。研究表明HRP5能有效杀灭耐药的白色念珠菌，且具有抗细菌、抗肿瘤及治疗关节炎的作用，作用机理独特，未发现毒副作用，不易诱导抗药菌株的产生，作为多肽类药物防治口腔等疾病潜力巨大1。唾液中HRP5含量低，采集唾液极为不便，提取过程繁琐，产率低；化学合成成本高；我们构建了含HRP5基因的原核表达载体，以望表达具有生物活性的HRP5。 1 材料与方法 1.1 材料 克隆载体pMD19Thrp5为前期构建2，原核表达载体pGEX4T1、大肠杆菌DH5购自invitrogen公司，限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、酶购自宝生物（大连）公司。氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、Yeast Extract、Tryptone、DNA Marker购自武汉凌飞科技公司，引物由上海英骏公司合成。 1.2 提取质粒pGEX4T1 将含pGEX4T1的菌株于含 Amp（100g/ml）的固体LB培养基上划线，37倒置培养过夜。 选择生长良好的单菌落，接种至4ml含Amp（100g/ml）的LB培养基，37 200转/min（rpm）振荡培养12h。 取1.5 ml2菌液，按试剂盒抽提质粒。 1.3 目的片段的酶切和回收 按文献2体系，酶切5份克隆载体，合并反应液，沉淀后进行2琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，按试剂盒回收。 1.4 酶切表达载体并回收 酶切体系如下： pGEX4T1 6l 10H Buffer 6l EcoR 2l Sal2l dH2O 44l 温和混匀，37水浴4h；加入120l无水乙醇，6l 3mol/L 醋酸钠，混匀，-80沉淀1h；12000 rpm离心5min，弃乙醇，600l 70乙醇洗涤沉淀，12000 rpm离心5min，弃乙醇，室温风干，加入20l dH2O溶解沉淀，0.8琼脂糖凝胶电泳分离，按试剂盒回收表达载体。 1.5 表达载体构建 取目的片段及酶切载体各4l，10ligation buffer 1l，T4 DNA ligase 1l，混匀，16连接过夜。转化DH5感受细胞，于含Amp（100g/ml）的LB培养基筛选阳性菌落。 1.6 重组表达载体的鉴定 1.6.1 PCR鉴定 挑取阳性菌落，用鉴定引物P1: 5GTGAATTCGACTCTCATGCG 3,P2: 5ATGTCGACATAACCGCGATG 3 PCR鉴定，反应体系：dNTPs（10mmol/L）1l，10buffer 5l， MgCl2（25mmol/L）3l，P1(5pmol/L) 2l，P2(5pmol/L) 2l，Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.25l，ddH2O 36.5l。循环参数：始变性 95 3min；94 30s，54 30s，72 30s 30个循环；72延伸10min。扩增后电泳检测。 1.6.2 酶切鉴定 培养PCR鉴定的阳性菌落，抽提质粒，酶切鉴定。酶切体系： pGEX4T1 20l 10H Buffer 10l EcoR 3l Sal3l dH2O 64l 温和混匀，37水浴4h；按1.4方法沉淀、洗涤、溶解，2.0%琼脂糖凝胶鉴定。 1.6.3 测序鉴定 将1.6.2酶切鉴定的阳性质粒送宝生物（大连）公司进行DNA序列测定。 2 结 果 2.1 质粒pGEX4T1的提取 电泳后可见1、2泳道抽提片段大小位于43676557bp，与质粒pGEX4T1（4900bp）相符，即为所需质粒（图1）。 2.2 重组表达载体的鉴定 2.2.1 PCR鉴定 由图2可知，重组质粒PCR产物略小于100bp，与目的片段（92 bp）长度相符。 2.2.2 酶切鉴定 酶切后鉴定结果如图3，重组载体双酶切（1、2泳道）后出现略小于100bp片段，与插入目的基因大小一致。 2.2.3 重组载体序列测定 将PCR、酶切鉴定的阳性重组载体送宝生物（大连）公司进行序列测定，结果表明，目的基因正确重组至表达载体pGEX4T1，无点突变、移码突变。 图 1 质粒pGEX4T1的提取 M：DNA Marker；12：pGEX4T1 图2 重组载体PCR鉴定 M：DNA Marker；1：PCR鉴定产物；2：阴性对照 图 3 重组载体酶切鉴定 M：DNA Marker；12： 重组载体 EcoR I+Bam H I双酶切 3 讨 论 HRP5是一种具有细菌毒性的蛋白，对大肠杆菌有一定杀伤作用，不宜选择组成性表达的原核载体。本实验选用的表达载体pGEX4T1在酶切位点的5 端带有编码谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，将目的片段插入其下游，可与其融合表达。由于GST可干扰HRP5的空间结构的形成，屏蔽或降低HRP5对大肠杆菌的细胞毒作用，以利其在细胞中高效表达，同时利用GST与标记有谷胱甘肽的的凝胶进行亲和层析，便于融合蛋白表达后分离纯化。 HRP5基因不足100bp，只占重组载体分子量的极小部分，酶切后电泳条带不明显，应增加酶切体系中重组载体量，保证有足量的酶切片段，增强鉴定目的片段亮度，以便确认重组与否。 pGEX4T1载体在GST近BamH I位点处有凝血酶（Thrombin）水解位点，可水解融合蛋白，获取重组HRP5。【参考文献】 1Oppenheim FG，Xu T，McMillian FM,et alHistatins，a novel fa