喉鳞癌组织与相邻正常黏膜的基因表达谱差异.doc

喉鳞癌组织与相邻正常黏膜的基因表达谱差异【摘要】 目的：研究喉鳞癌组织与相邻正常黏膜的基因表达谱差异。方法：对2例经病理证实的喉鳞状细胞癌标本和邻近的正常黏膜组织标本与基因表达谱芯片进行杂交，利用激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片杂交信号，获得样品中基因序列及表达信息。结果：对比2例喉癌和邻近正常组织的基因表达图谱，发现癌组织和正常组织存在差异表达，2例标本重复出现且差异表达的基因共74个，其中喉癌组织表达上调的基因(R5)27个，表达下调的基因(0R0.2)47个。结论：利用基因表达谱芯片可以在喉鳞状细胞癌组织和邻近的正常组织之间一次比较7000多个基因表达变化，并能找出病理组织中表达异常的基因。 【关键词】 喉肿瘤 鳞状细胞癌 基因表达 基因芯片 ADifferentially expressed genes in laryngeal squamous cell ABSTRACT Objective: To screen for the differentially expressed genes in laryngeal squamous carcinoma cells and normal laryngeal tissues using cDNA microarray. Methods: The samples from two laryngeal squamous carcinoma tissues were tested using DNA microarrays. The DNAs were fixed on a glass plate by a series of treatments. The mixed probes were then hybridized to DNA microarrays and scanned for fluorescent signals. Differences between the two tissues were produced. Results: Ran belonging to Ras gene family increased 12.207 times, RAB32 belonging to Ras gene family increased 4.904 times and BIRC5 (Survivin) increased 15.495 times. They were significantly highly expressed in laryngeal cancer. The GFI1B gene decreased 0.0265 times. The GATA1 gene was significantly lowly expressed in one laryngeal cancer and was not expressed in carcinoma cells of another patient. Conclusion: cDNA microarray made in our Lab can recognize more than 7000 gene differences between cancer tissues and normal tissues at the same time and find gene variation. These results accord with other studys. KEY WORDS Laryngeal neoplasms; Squamous cell carcinoma; Gene expression; DNA microarray 喉癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其中鳞状细胞癌占90%以上1。我们利用基因芯片法，对来源于不同个体、不同细胞周期、不同分化程度的细胞内的mRNA进行检测，分析正常组织与喉癌组织基因表达谱的差异，动态地了解细胞从正常到癌变的不同阶段基因表达谱的变化，为喉癌的早期诊断、治疗及预后评估提供理论基础。 1 资料与方法 1.1 临床标本 2例经病理证实的男性喉癌标本，由天津市第一中心医院耳鼻咽喉-头颈外科提供，患者分别为58、65岁；病理类型均为鳞状细胞癌，1例是T3N0M0，1例T4N1M0。根据临床分期行全喉切除术，术后即刻切取癌组织及邻近正常组织约700?mg，迅速放入液氮冻存。 1.2 表达谱芯片的制备 用自动点样仪(美国PE公司,SpotArray)将大约15?000个基因点于芯片片基上。点样区分为4个DNA矩阵,共包含7267个人类基因, 分为human cancer、 apoptosis、 signal transduction 和liver enzymes 4部分。每个人类基因有两个复点。点样后在杂交前于300?mJ紫外交联。待烤箱温度升至110? 130?后，迅速打开烤箱门，将装有玻片的提篮放入烤箱中干烤5?s后立即取出。0.2SDS的3SSC溶液摇动（60YPM）洗涤2次，每次1?min。高纯水摇动（60YPM）洗2次，每次1?min。0.256NaBH4摇动（60YPM）1?min封闭。高纯水摇动（60YPM）洗涤1次1?min。0.2SDS的3SSC溶液摇动（60YPM）洗涤1次1?min。高纯水摇动（60YPM）洗涤2次，每次1?min。将玻片放入离心管中，2?000?r/min离心5min（平角离心机）。取出，置于-20?备用。 1.3 差异基因检测 计算基因在标本中信号值的比值(Radio)，用以表示表达基因的差异性。 Radio(CH2 MedianCH2 B Median)/ (CH1 MedianCH1 B Median) 基因表达差异有显著性意义的判定标准为：(1)Radio5; (2)0Ratio0.2;(3)Ratio0且CH2 MedianCH2 B Median1000, Ratio0且CH1 MedianCH1 B Median1000。再进行一致性点的筛选，即选出同一基因的两个点的Radio都符合标准。最后将2例标本符合标准的数据对比，筛选出共同的基因。对筛选出的点作进下一步分析。 2 结 果 2.1 总RNA提取的定性定量分析及cDNA分析结果 将提取的喉癌组织和邻近正常组织的总RNA进行1琼脂糖凝胶电泳,其对应于28?s和18?s的两条带的亮度之比约为21，见图1。应用紫外分光光度法测得RNA在260nm和280nm的OD值比值,均在1.8 2.0之间，符合基因芯片实验要求。cDNA分析显色好，复点显色一致。 图1 RNA 1%琼脂糖凝胶电泳扫描图像 N：正常组织；C：喉癌组织 2.2 扫描结果 点样后及芯片处理后，采用共聚焦荧光扫描仪对芯片进行Cy3和Cy5荧光扫描，测定背景值，结果显示：芯片基因点清晰，没有基因点漏点、点重叠、以及不正常荧光的情况；Cy5的背景值均匀，符合要求，Cy3的局部背景偏高，但对结果的可靠性没有大的影响。 2.3 数据处理结果 Ras类基因中的Ran、RAB32、BIRC5（Survivin）基因表达在喉癌组织中分别上调12.2、4.9和15.5倍；GFI1B基因下调2.65%,GATA1基因在1例标本中的表达下调1.06%，而在另1例标本癌细胞中未表达。 3 讨 论 与癌发生相关的基因可分为三类：癌基因、肿瘤抑制基因和监视基因。其中，癌基因对正常的细胞周期起刺激作用，并给予细胞生长或生存能力。癌基因的过度表达可促进细胞异常生长，细胞死亡减少；肿瘤抑制基因可阻止异常细胞发育，其缺失可导致异常细胞增殖并形成癌。肿瘤抑制基因的失活导致细胞的生长调节和凋亡紊乱，诱导肿瘤的发生；监视基因与异常DNA的检测和修复有关，该类基因缺失可导致异常基因在细胞中积累2。本研究显示喉癌与许多基因的异常表达有关。主要是以下几个基因。 3.1 Ras类原癌基因 Ran基因家族是Ras超级家族的五个次家族之一，主要负责细胞生长增殖的信息传递。Ran基因的蛋白产物，是一种大量分布于细胞核内的GTP酶3。许多证据表明，Ran及其结合蛋白参与调控细胞周期中的多个过程。Ran基因在大多数癌组织表达上调。但是，在周围的正常组织中的表达没有提高，而且通常无法检测到4。在本研究的2例标本中，Ran基因的表达在喉癌组织中均明显上调，平均上调约为12.2倍。另外一个Ras类基因RAB32在喉癌组织中表达亦上调，平均上调4.9倍。其他Ras类基因在喉癌中上调幅度很小，说明Ras类基因与喉癌的联系不紧密。 3.2 生存蛋白基因（Survivin） 1997年耶鲁大学Ambrosini等5用效应细胞蛋白酶受体1（effect cell protease receptor1，EPR1）cDNA在人类基因组文库中筛选出Survivin基因。 有研究表明，Survivin基因是至今发现的最强的凋亡抑制因子，可直接作用于细胞色素C从线粒体向胞质释放的过程的末期6。在体外将Hela细胞阻断在G1、S、G2/M期，检测Survivin mRNA的表达，发现在G1期检测不到，在S期增加6 7倍，在G2/M上调40倍7。本研究所用的2例标本中，BIRC5（Survivin）基因在喉癌组织中表达均显著上调，平均上调15.5倍，且在邻近正常组织中荧光值极低，几乎检测不到。有研究表明，Survivin的组织分布具有明显的细胞选择性，即在终末分化的成人组织中不表达（胸腺、生殖腺除外），而在大多数肿瘤组织中表达。Survivin阳性表达与喉鳞状细胞癌患者的年龄、性别、临床分型无相关性，与喉鳞状细胞癌TNM分期、组织分化程度、淋巴结转移相关。因此，我们可以初步推测，以Survivin的表达水平为检测指标，对于判断喉鳞状细胞癌的病情发展有重要意义。 3.3 GATA1与GFI1B基因 GATA1位于X染色体上，为正常红细胞发育和分化成熟所必需。GATA1的表达严格限制于造血细胞系，主要调控红细胞的增殖与分化，对巨核细胞、肥大细胞及嗜酸性粒细胞也起一定的作用。已经有研究表明，转录因子GATA1与顺式序列相互作用很可能会实现对细胞增殖和分化的调节。GFI1B基因位于9q34.13，通过调节红细胞特异靶基因的表达而发挥调节作用。近期的研究表示GFI1B基因表达的改变会导致红细胞在不同生长阶段的增殖和分化8。GFI1B和GATA1的相互作用调节红细胞的增殖，当GFI1B和GATA1发生突变时，红细胞的生长受到抑制，进而导致癌细胞的过度生长。 本研究发现，GFI1B基因在喉癌组织中的表达均显著下调，平均下调2.65%；GATA1基因在2例标本的喉癌组织中下调1.06%，而在另1例喉癌组织中未表达。其与喉癌发生、进展是否相关有待进一步研究。【参考文献】 1 ZK(#刘兆华主编.现代喉外科学M.北京：军事医学科学出版社，2001.269284.2 王斌全，陈彦球，温树信，等.复发喉鳞状细胞癌相关基因表达谱研究J.临床耳鼻喉咽科杂志，2003，17（6）：339341.3 Koichi Azuma, Tetsuro Sasada, Hiroko Takedatsu, et al. Ran, a small GTPase gene, encodes cytotoxic T lymphocyte(CTL) epitopes capable of inducing HLAA33restricted and tumorreactive CTLs in cancer patients J. Cancer Res, 2004, 10:66956702.4 蒋青, 卢智刚, 张传茂. Ras类原癌基因产物Ran GTPase在细胞增殖调控中的作用J. 科学通报, 2004, 49 (4): 308314.5 Ambrosini G, Altieri DC. A novel antiapoptosisi gene, Survivin, expressed in cancer and lymphomaJ. Nat Med, 1997, 3: 917921.6 姜琳琳, 韩瑞珠, 徐秀玉, 等. Survivin、bcl2和bax在喉鳞状细胞癌中的表达. 中国耳鼻咽喉头颈外科，2005, 12: 243246.7 Tamm I, Wang Y, Sausville E, et al. IAPfamily protein surviving inhibits caspase activity and apoptosis induced b