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多巴胺D1受体在帕金森脑黑质纹状体的表达 作者：樊平 石葛明 康云霄 郭巍巍 王磊【摘要】 目的 观察帕金森（PD）病人脑黑质纹状体多巴胺D1受体的表达变化。方法 采用免疫放射自显影法观察PD标本(PD组)中黑质纹状体多巴胺D1受体的含量改变，并与非神经系统疾病脑标本(对照组)进行对照研究。结果 PD组多巴胺D1受体标记信号在壳及尾状核比对照组减弱，黑质多巴胺D1受体的标记信号比对照组增强；灰度值分析显示，壳及尾状核的灰度值比对照组分别增加了11.35%和10.52%，而黑质比对照组减了48.89%（P<0.01）。结论 多巴胺D1受体在PD人脑标本壳及尾状核的表达降低、黑质表达增加。 【关键词】 帕金森病；多巴胺D1受体；纹状体；黑质研究表明，帕金森病（Parkinsons disease，PD）是由中脑黑质多巴胺能神经元退行性变导致纹状体相应神经支配减少所致的神经退行性疾病，目前左旋多巴（LDOPA）替代疗法仍是PD的主要治疗手段1，在疾病的初期会起到很好的治疗效果，但随之出现的药效减退及异动症等副作用影响了PD的治疗2。LDOPA引起的副作用的机制目前尚不十分清楚，推测与多巴胺受体的表达改变、进而导致基底神经节传出活动障碍有关。研究表明，多巴胺D1受体主要分布于基底神经节传出通路直接通路上的中型有棘GABA能神经元3，在运动调控中起着重要的作用4，多巴胺D1受体的表达变化明显改变基底神经节的传出活动。有关PD时多巴胺D1受体在基底神经节表达改变的研究结论不一5，6。本研究利用免疫放射自显影技术观察PD患者脑黑质纹状体多巴胺D1受体表达的变化，探讨LDOPA产生副作用的机制。1 材料与方法1.1 材料人脑标本8例，4例死亡前诊断为PD（PD组），死亡后病理检查确诊，在治疗期间均有LDOPA服药史；另4例为死于非中枢神经疾病患者（对照组）。1.2 方法尸检脑标本切成35 mm，经10%甲醛固定、石蜡包埋。石蜡块行常规切片，片厚8 m。裱片、脱蜡入水后分别进行0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH6.0）抗原修复、0.2 % TritonX100、8%正常羊血清预处理（4，1 h）、1250大鼠单克隆抗多巴胺D1受体抗体孵育（4，48 h）、小鼠抗大鼠IgG（1100）室温孵育2 h、125I标记的羊抗小鼠IgG（1 Ci/ml）室温孵育1 h，每步间以TBS洗片3次。125I标记的切片经洗片、风干，将载片置于放射自显影盒内，载片上覆以 Kodak Biomax MS胶片，曝光7 d，行显影、定影。对照组省去一抗，余者相同。1.3 图像分析将胶片扫描，分辨率为300 dpi，以TIFF格式储存。利用ImageJ 软件测量有关脑区的灰度值。1.4 统计学分析所得数据用xs表示，采用t检验。2 结果2.1 壳、尾状核及黑质多巴胺D1受体免疫反应对照组多巴胺D1受体标记信号主要分布于新纹状体的壳及尾状核；旧纹状体的外侧苍白球、内侧苍白球仅见微弱的标记；边缘纹状体的伏核也可见较弱的标记信号。中脑黑质可见较强的多巴胺D1受体标记信号。PD组多巴胺D1受体标记信号在壳及尾状核明显减弱；黑质多巴胺D1受体的标记信号明显增强，见图1。2.2 PD黑质纹状体多巴胺D1受体表达的灰度值变化壳及尾状核的灰度值比对照组分别增加了11.35%和10.52%，而黑质则比对照组减少了48.89%（P<0.01）。见表1。表1 PD黑质纹状体多巴胺D1受体表达的灰度值变化(略)3 讨论 以往研究表明，多巴胺D1受体主要存在于参与基底神经节中纹状体传出联系“直接通路”的壳及尾状核，直接投射到内侧苍白球和黑质网状部的GABA能投射神经元3，激活多巴胺D1受体能够提高腺苷酸环化酶的活性，从而抑制“直接通路”内侧苍白球和黑质网状部的GABA能传出神经元，进而兴奋丘脑皮质投射神经元，增强丘脑皮质通路的活动；壳及尾状核多巴胺D1受体表达的降低最终将导致丘脑皮质通路活动的减弱。本研究显示，壳及尾状核多巴胺D1受体的表达减少，黑质多巴胺D1受体的表达增加。PD患者脑壳及尾状核多巴胺D1受体表达的减少一方面可能与黑质多巴胺神经元退性变后投射到这些脑区多巴胺的减少7，导致多巴胺D1受体表达减少有关；另一方面也可能是在疾病治疗过程中LDOPA的使用改变了多巴胺D1受体的表达所致。黑质多巴胺D1受体表达的增加可能与黑质致密部多巴胺能神经元退性变后星形胶质细胞增生有关；细胞培养的研究证实，星形胶质细胞能够表达多巴胺D1受体8，胶质细胞的增生导致了该区域多巴胺D1受体的增多。此外，黑质多巴胺D1受体表达的增加也可能与黑质网状部GABA能神经纤维多巴胺D1受体含量增加有关；免疫细胞化学的研究显示，黑质网状部也存在多巴胺D1受体，位于来自壳及尾状核GABA能神经元的轴突或轴突末梢。由于本研究所采用的方法难以确切区别黑质的致密部和网状部，因此不能排除PD组黑质多巴胺D1受体的增加是由于网状部多巴胺D1受体含量增加所致的可能性，其意义尚难推测。 以往对PD人脑标本多巴胺D1受体含量变化的研究主要是利用配基受体的放射自显影方法，研究结果多不一致，表现为壳和尾状核多巴胺D1受体的增加、降低或没有改变5，6。这些结果的差异很可能与疾病过程中药物的应用，特别是LDOPA的使用有关。研究显示，多巴胺激动剂能够引起多巴胺D1受体的胞内化9，从而导致配基配体的研究方式检测不到这部分受体，从而呈现无改变的假象，LDopa在疾病治疗过程中的应用也可能会产生同样的作用。本研究采用多巴胺D1受体特异性抗体识别抗原的免疫放射自显影方法，能够检测组织内蛋白含量的改变，可真实反映多巴胺D1受体含量的变化。有研究表明， 6羟多巴胺大鼠PD模型尾壳核多巴胺D1受体明显降低10，提示长期的多巴胺缺乏降低了支配靶区壳及尾状核多巴胺D1受体的表达。还有研究发现，给予正常大鼠施予多巴胺D1受体激动剂对其运动行为几乎没有明显的影响，然而对PD大鼠却产生明显的运动行为改变，提示可能与PD时脑内存在多巴胺D1受体的超敏感有关。 综上，结合本研究及其他研究结果5，10认为，超敏很可能与D1受体激活后，其下游效应因子活性增强，从而引起D1受体功能性超敏有关，是否如此值得进一步研究。【参考文献】 1 Hauser RA.Levodopa：past，present，and futureJ.Eur Neurol，2009；62(1):18.2 Nagatsua T，Sawadab M.Ldopa therapy for Parkinsons disease：past，present，and futureJ.Parkinsonism Relat Disord，2009;15(Suppl 1):S38.3 Wooten GF.Anatomy and function of dopamine receptors：understanding the pathophysiology of fluctuations in Parkinsons diseaseJ. Parkinsonism Relat Disord，2001；8(2):7983.4 刘絜，陈燕，任志华，等.多巴胺受体D1在小鼠运动调节方面的作用及与帕金森病的关系J.第四军医大学学报，2007；27(11):9758.5 Xu ZC，Ling G，Sahr RN，et al.Asymmetrical changes of dopamine receptors in the striatum after unilateral dopamine depletionJ.Brain Res，2005;1038(2):16370.6 Araki T，Tanji H，Kato H,et al.Temporal changes of dopaminergic and glutamatergic receptors in 6hydroxydopaminetreated rat brainJ.Eur Neuropsychopharmacol，2000;10(5):36575.7 石葛明，李双成，王志红，等.帕金森病患者脑标本黑质、纹状体内多巴胺转运体蛋白的表达J.中华神经科杂志，2005;38(8):4957.8 Zanassi P, Paolillo M, Montecucco A, et al. Pharmacological and molecular evidence for dopamine D(1) receptor expression by striatal astrocytes in cultureJ. J Neurosci Res,1999;58(4)：54452.9 Muriel MP，Bernard V，Levey AI,et al.Levodopa induces