大鼠重症急性胰腺炎胰腺组织中NO生成及iNOS表达的变化.doc

大鼠重症急性胰腺炎胰腺组织中NO生成及iNOS表达的变化【摘要】 目的探讨重症急性胰腺炎(SAP)时胰腺组织一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的变化。方法36只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为2组。SAP组(n=18)以逆行胰胆管内加压注射5%牛磺胆酸钠的方法建立SAP模型;对照组(n=18)以同法注射等剂量生理盐水。造模后6、12、24 h每组随机处死大鼠6只，检测血淀粉酶、胰腺组织病理组织学改变、胰腺组织NO水平及iNOS活性以及腺腺组织iNOS mRNA表达的变化。结果与对照组相比，SAP组在6 h时间点上，胰腺组织中NO水平、iNOS活性明显升高(P<0.01)，免疫组化和RT-PCR结果也显示iNOS蛋白及iNOS mRNA表达增高(P<0.01);随时间延长，在12 h和24 h各指标到达高峰，24 h仍维持在较高水平(P<0.01)。结论在SAP时，随着时间的延长，iNOS表达增高，从而产生高浓度的NO，加重胰腺组织的损伤。 【关键词】 重症急性胰腺炎;一氧化氮;诱导型一氧化氮合酶 Abstract: ObjectiveTo investigate the changes in the formation of nitric oxide (NO) and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in pancreatic tissue in severe acute pancreatitis (SAP) in rats. MethodsThirty-six healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly allocated into sham-operated group (control group) and SAP group (n=18 each). The model of SAP was established by injection of 5% sodium taurocholate into the common choledocho-pancreatic duct in SD rats. The same dosage of normal saline was given to the control group in the same way. The rats were randomly sacrificed at 6 h, 12 h and 24 h, respectively (n=6 each), and their blood samples were collected for analyses. The variation of serum amylase levels and the pathohistological changes of the pancreas were detected by colorimetric method. The expression of iNOS proteins and iNOS mRNA in the pancreas were determined by immunohistochemistry and reverse transcriptase polymerase chain reaction method (RT-PCR), respectively. ResultsThe NO level and the activity of total iNOS in the pancreas at 6 h significantly increased in the SAP group as compared to the control group (P<0.01). Immunohistochemistry and RT-PCR also revealed an increase in the expression of pancreatic iNOS protein and mRNA in the pancreas (P<0.01). Each parameter increased with time and reached the peak at 12 h and still retained a high level at 24 h (P<0.01). ConclusionIn SAP, the iNOS expression was upregulated with time and thus the high concentration of NO was produced, which aggravated the lesion of pancreatic tissue. Key words： severe acute pancreatitis; nitric oxide; inducible nitric oxide synthase 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)临床表现凶险，常发生局部或全身并发症;目前对SAP的治疗虽有所进展，但如何防治SAP仍无特异手段，导致SAP的病死率居高不下。近年来研究发现，一氧化氮(nitric oxide, NO)在SAP的发生与发展过程中起着重要作用。本实验通过制备大鼠SAP模型，探讨NO、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)与胰腺组织损伤的关系。 1材料和方法 1.1实验动物健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，体重200250 g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供。 1.2主要试剂和仪器牛磺胆酸钠(Sigma公司)，NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，iNOS免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TIANScript M-MLV RT-PCR试剂盒(上海捷瑞生物公司)，iNOS及-actin引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。全自动生化分析仪(美国Vitros公司)。 1.3方法 1.3.1动物分组及SAP模型制备36只大鼠随机分为2组。SAP组(n=18)： 采用Aho法1，逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)制备SAP模型;对照组(n=18)：处理方法同SAP组，以等量生理盐水替代5%牛磺胆酸钠。于制模成功后第6、12、24 h，每组分别随机选取6只大鼠，予以牵拉颈部处死。心脏穿刺抽血，血清存于-20冰箱中保存备检;从胰腺相同位点分别取胰腺组织立即放入液氮中，2 h后转入-70冰箱中保存;部分胰腺组织用10%中性甲醛固定2448 h，常规脱水、包埋。 1.3.2血清淀粉酶的测定用全自动生化分析仪，采用碘比色法测定血清淀粉酶。 1.3.3胰腺组织病理学观察胰腺组织常规浸蜡、包埋，3 m厚度切片，苏木精-伊红染色。光镜下(100)每张切片随机选取10个高倍镜视野，从水肿、感染、出血和坏死4个方面评价胰腺组织损伤的程度。参考Kusske标准2，由2位专业病理医师双盲阅片;各项最低分为0，最高分为4分;取各项积分总和为最终得分。 1.3.4胰腺组织NO的检测取冰冻胰腺组织100 mg，加入生理盐水，制备成10%的组织匀浆，低温离心(3 000 r/min)10 min，取上清液，根据试剂盒说明书完成NO含量的检测。NO活性单位以mol/g 表示。同时用考马斯亮蓝G-250测定组织蛋白。 1.3.6胰腺组织iNOS免疫组织化学测定严格按照试剂盒说明操作。一抗(兔抗大鼠)工作浓度1100,以PBS代替一抗作为空白对照。以细胞出现棕黄色颗粒作为阳性反应。高倍镜下(400)，每张切片随机选5个视野,每个视野在阳性表达及背景各取5个点的灰度值，以两者之差的绝对值作为阳性表达的灰度，计算每个视野的灰度平均值，再计算5个视野的平均值作为该片的灰度表达值。采用LEICA QWIN STANDARD V23图像处理与分析系统完成图像分析。 1.3.7iNOS mRNA的RT-PCR检测引物序列为：iNOS140-F:5-TGC CCT GCA GAC TGG ATT TG-3(AA79218)，iNOS140-R:5-TCC TGC CAG ATG TGG GTC TTC-3 (AA79219);-actin452-F:5-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3(AA79226)，-actin452-R:5-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3(AA79227)。以BandScan 5.0软件对条带进行分析，以目的基因iNOS mRNA的扩增量/内参-actin的扩增量表示iNOS mRNA的相对表达量。 1.4统计学处理采用Sigma Stat 2.03对实验数据进行统计分析。数据以s表示。组间比较采用t检验;组内各时间点的比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，两两比较采用q检验(Newman-Keuls test)。P<0.05认为差异有统计学意义。 2结果 2.1血清淀粉酶的变化SAP组血清淀粉酶6 h开始明显升高(P<0.01)，随时间的增加而逐渐升高，24 h达到高峰(P<0.01);SAP组各时间点血清淀粉酶水平均明显高于对照组(P<0.01)。见表1。表12组造模后各时间点血清淀粉酶的变化 2.2病理组织学变化与对照组比较，SAP组各时间点病理改变显著，制模后6 h可见点状坏死灶，间质水肿，伴中性粒细胞浸润，小叶结构紊乱，腺泡细胞颗粒样或空泡样变性;制模后12 h可见片状凝固坏死，大量中性粒细胞分布于间质，红细胞分布于间质或片状存在于胰腺组织内;制模后24 h胰腺组织大片坏死，伴大量中性粒细胞浸润，腺叶排列紊乱，坏死区腺泡结构消失，腺泡萎缩，有胞核的溶解和消失。病理损害评分SAP组与对照组同时间点相比显著增高(P<0.01);SAP组12 h和24 h较6 h明显增高(P<0.01)，24 h到达高峰，12 h和24 h相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图1及表2。图12组大鼠造模后各时间点胰腺组织病理学变化(苏木精-伊红染色，100)A.对照组;B.SAP组6 h;C. SAP组12 h;D.SAP组24 h表22组大鼠造模后各时间点胰腺病理组织学评分变化 2.3胰腺组织NO水平的变化对照组各时间点NO水平没有明显变化;SAP组6 h相对于对照组已有明显升高，随着时间的增加在12 h到达高峰(P<0.01)，24 h仍维持较高水平，但12 h和24 h 2组NO水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。表32组大鼠造模后各时间点胰腺组织NO水平的变化 2.4iNOS活性的变化SAP组iNOS活性在6 h相对于对照组已明显升高，12 h和24 h到达高峰(P<0.01)，12 h和24 h之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。表42组大鼠造模后各时间点胰腺组织iNOS活性的变化 2.5免疫组织化学iNOS蛋白表达的变化iNOS蛋白在胰腺组织中的阳性表达主要存在于血管内膜、平滑肌和胰岛细胞的细胞质中，以胰岛细胞的细胞质中为主3 。对照组各时间点未见阳性表达。SAP组造模后6 h即可见胰岛细胞质内有淡棕黄色阳性表达，随着时间的延长在12 h胰岛细胞质内棕黄色染色颗粒增加，颜色变深，阳性表达越来越明显，在24 h表现为典型的棕黄色颗粒，阳性表达更加明显。灰度值测定可见：相对于6 h，SAP组12 h和24 h阳性表达明显(P<0.01)，以24 h最为明显，但12 h与24 h之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图2及表5。 2.6胰腺组织iNOS mRNA表达的变化对照组未见iNOS mRNA的表达或表达非常微弱;SAP组各时间点iNOS mRNA的表达均明显高于对照组(P<0.01);SAP组6 h即有明显表达，与6 h相比12 h表达最为明显，24 h仍维持在较高水平(P<0.01)。见图3及表6。图22组大鼠造模后各时间点胰腺组织中iNOS的表达(免疫组化SP法)A.对照组(100);B.SAP组6 h(400);C. SAP组12 h(400);D.SAP组24 h(400)表52组大鼠造模后各时间点胰腺组织iNOS蛋白表达的变化图3iNOS mRNA电泳结果M. Marker 50500 bp;1.对照组6 h;2.对照组12 h;3.对照组24 h;4.SAP组6 h;5.SAP组12 h;6.SAP组24 h表62组大鼠造模后各时间点胰腺组织iNOS mRNA表达的变化 3讨论 NO是一种具有扩血管作用的不稳定性体液因子。因其半衰期极短(仅为26 s)，且可自由地通过细胞膜发挥生物活性作用，因此被认为是一种理想的信使分子。一氧化氮合酶(NOS)是NO合成过程中的关键酶，分为神经型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和iNOS 3种类型。作为NOS的主要分型，iNOS的作用主要体现在病理情况下，如感染、炎性细胞因子刺激等，而在正常生理情况下则几乎不表达4。 对于NO在SAP发病中的作用，目前的报道不多且存在很多争议。Ayub等5 发现，急性胰腺炎大鼠的血管内皮细胞、 平滑肌细胞以及腹腔巨噬细胞iNOS表达增强，血清NO含量升高，因而推测NO参与了胰腺组织的损伤过程;但Weidenbach等6并未观察到此类改变，相反，发现水肿性胰腺炎大鼠在输注NO合成酶抑制剂后，胰腺血流减少且胰腺炎病情加重，因此推测NO对胰腺微循环有保护作用。 本研究中，我们借助SAP大鼠模型，通过对血清淀粉酶、胰腺病理损害、胰腺组织中NO水平等相关指标的检测分析，提示 NO水平的增高可能是SAP时胰腺组织损伤的重要原因之一。进一步的研究显示，SAP大鼠iNOS蛋白和mRNA基因表达增高，随观察时间的延长呈上升趋势，并与NO的增高具有时间上的一致性。由此我们认为，SAP时，随着胰腺炎的发展和胰腺组织损伤加重，iNOS表达增加，从而产生高浓度的NO;而高浓度的NO具有细胞毒性，反过来加重胰腺组织的损伤。其可能的机制为：胰腺在正常时iNOS不表达或微量表达，而在胰腺炎发展过程中产生大量的细胞因子、中性粒细胞、内毒素、炎性介质等可激发iNOS的表达，从而产生高浓度的NO，过高浓度的NO加重了胰腺组织的损伤。 【参考文献】 1Aho HJ, Nevalainen TJ， Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis J.Scand J Gastroenterol,1980,15(4):411-416. 2Kusske AM, Rongione AJ, Ashley