异位子宫内膜细胞中整合素α5的表达及其性激素调控.doc

异位子宫内膜细胞中整合素5 的表达及其性激素调控【关键词】 异位子宫内膜细胞 Abstract:Objective To investigate how asthmatic patients handle metered dose inhaler（MDI）and turbuhaler.Method Asthmatic patients having used MDI and turbuhaler for sometime were investigated，who demonstrated the using of MDI or turbuhaler2-3times，just as the way they used at home or community.After careful observation，their mistakes were found out and recorded，individual health education and instruction of using MDI and turbuhaler were given.Results The rate of correct use of MDI was12.8%（19.149）.The rate of correct using of turbuhaler was41.5%（17.41）.After health education and skill training，they respectively went up to81.9%（122.149）and87.8%（36.41）.Conclusion At present health edu-cation and management of asthma is still weak.It is an important component element to raise asthma control rate.Key words:asthma;metered dose inhaler;turbuhaler;inhaling-therapy;health education 摘要目的: 探讨异位子宫内膜细胞中整合素5 的表达及性激素对其的影响。 方法: 对18例卵巢子宫内膜异位症（EM）患者的异位子宫内膜组织行体外细胞培养并传代。传代培养中细胞分为非药物干预组（对照组）、雌二醇（E2 ）组、安宫黄体酮（P）组、米非司酮（RU486）组、三苯氧胺（TAM）组5组，细胞收获后用逆转录.聚合酶链反应技术检测各细胞组中整合素5 mRNA的表达。 结果: 整合素5 在E2 组及P组的表达水平分别为1.4150.286及1.3040.170，与对照组的1.0820.069相比，差异具有统计学意义（P<0.05），而TAM组及RU486组中整合素5 表达水平（分别为0.8820.013及1.3040.170）明显低于对照组（P<0.05）。 结论: 整合素5 表达受雌、孕激素调控，E2 、P可能通过上调整合素5 的表达而促进EM粘附的发生，TAM、RU486可能通过拮抗E2 、P或抑制异位内膜细胞分泌整合素 5 分子而延缓EM的发展，从而起到治疗作用。 关键词 异位子宫内膜细胞;细胞培养;整合素5 ;逆转录.聚合酶链反应;性激素 子宫内膜异位症（endometriosis，EM）的发病机制尚未完全阐明，研究证据较多的仍为子宫内膜种植学说，同时EM也是一种性激素依赖性疾病。研究表明，整合素分子在EM的发生、发展中起着重要作用。为探讨整合素5 在EM发病中的作用，作者进行了异位子宫内膜细胞的原代培养并予药物干预，用逆转录.聚合酶链反应（RT.PCR）技术检测各细胞组中整合素5 mRNA的表达，了解整合素5 在EM异位内膜中的表达情况及性激素对其的调控作用。 1 对象与方法 1.1 研究对象 2003年9月至2004年4月间在东南大学附属中大医院妇产科和南京市鼓楼医院妇产科，因卵巢子宫内膜异位囊肿行腹腔镜手术或剖腹手术的患者18例，年龄2342岁，平均（36.62.4）岁，术前3个月内均未用EM治疗药物或激素类药物，术后病理组织学检查均证实为卵巢EM。手术均在排卵前进行。 1.2 方法 1.2.1 标本收集处理 手术剥除卵巢囊肿后，在无菌条件下取新鲜囊肿囊壁组织，大小约4cm4cm，将所取标本置入4、无菌、含青霉素及链霉素的D.Hank 液的取样瓶中，立即送回实验室进行培养。 1.2.2 原代细胞培养 参考文献1，2方法进行异位子宫内膜细胞体外培养。培养液为含10%胎牛血清的11DMEM.F12 ，置于37、体积分数为0.05的CO2 培养箱内培养，每23d换液1次。于光镜下观察原代细胞形态及生长情况。 1.2.3 细胞传代培养及分组 原代细胞全部或大部分融合后用0.125%胰蛋白酶消化传代，3d细胞开始融合时分为5组。（1）对照组:即非药物干预组，单纯DMEM.F12 培养液培养;（2）雌二醇（E2 ）组:含10nmol・L-1 17.E2 的DMEM.F12 培养液培养;（3）安宫黄体酮（P）组:含100nmol・L-1 P的DMEM.F12 培养液培养;（4）米非司酮（RU486）组:含1000nmol・L-1 RU486的DMEM.F12 培养液培养;（5）三苯氧胺（TAM）组:含1000nmol・L-1 TAM的DMEM.F12 培养液培养。继续培养67d，至细胞基本长满瓶底时开始收获。 1.2.4 异位内膜细胞中整合素5 表达的检测 （1）各细胞组中总RNA的提取及鉴定:总RNA提取试剂Trizol购自美国Gibco公司，严格按说明书操作。测定260nm和280nm波长处的吸光度（A），A260 .A280 值在1.72.0范围内。（2）引物设计及内参建立:引物序列参考文献3，4，经对人类基因库扫描未发现其它同源序列。整合素5 及内参2 .微球蛋白（2 .MG）引物由上海捷倍思生物工程公司合成。整合素5 序列:5.CATTTCCGAGTCTGGGCCAA.3，5.TGGAGGCTT GAGCTGAGCTT.3，碱基对长320bp;2 .MG序列:5.CCACTGAAAAAGATGAGTAT.3，5.CTTCAACCTCCA GATGCTG.3，碱基对长120bp。（3）RT.PCR条件:采用两步法，RNA酶抑制剂、单克隆鼠白血病病毒逆转录酶（M.MLV）及Taq酶均购自上海生工生物工程公司。先行RT，反应体系25l，PCR仪上42转录60min，955min灭活M.MLV，立即冰浴冷却。PCR反应体系50l，反应条件参考文献3，4并加以改进。（4）PCR产物测定:PCR产物进行1.7%琼脂糖凝胶电泳，80V40min，凝胶扫描图像分析系统摄像并分析各目的条带灰度值（OD1 ）。以2 .MG灰度值（OD2 ）为对照，计算PCR产物相对量，用OD1 .OD2 值代表整合素5 mRNA的表达水平。 1.3 统计学处理 实验结果均以xs表示，应用SPSS12.0统计软件包进行单因素方差分析，P<0.05表示有显著性差异。 2 结 果 2.1 体外培养的异位内膜细胞的形态特点 原代培养的子宫异位内膜细胞在倒置显微镜下观察，腺上皮细胞呈插入性生长，细胞为星形、多角形。接种3d后，细胞呈旋涡状紧密排列，成团生长，胞质呈颗粒状，核圆而大，核仁明显;间质细胞则呈伸展、挺直状，核圆居中。 2.2 异位内膜细胞各组整合素5 mRNA表达水平各组反应物均有相应的扩增带:整合素5 320bp，2 .MG120bp（图1）。各组OD1 .OD2 值见表1，各药物干预组与对照组比较均具有显著差异（均为P<0.05），但E2 组与P组间、RU486组与TAM组间无显著差异（P>0.05）。 表1 各细胞组中整合素5（略）3 讨 论 3.1 整合素与EM的关系 整合素是一类广泛分布于细胞表面、连接细胞外基质蛋白及传导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间信号的粘附分子受体，由、亚单位通过非共价键连接组成的异二聚体。目前已发现至少有18种亚单位和8种亚单位，组合成20多种整合素分子，其主要M为Marker;15依次为E2 组、P组、RU486组、TAM组及对照组功能是粘附和信号传导。有研究提示，异位内膜的生长及其与周围盆腔腹膜形成粘连有赖于整合素与基质间的相互作用5 。整合素在细胞的侵袭和种植过程中起着至关重要的作用，它不仅连接细胞和细胞外基质，而且通过信号传递和接收来调整此过程的发生6 。Beliard等7 研究了18例因疼痛和不孕行腹腔镜手术的EM患者子宫内膜和异位内膜的整合素表达，发现整合素4 1 、5 1 表达有明显特异性，且5 在位内膜腺体无表达，而异位内膜则持续表达，在位内膜增殖期缺乏4 ，而异位内膜上皮细胞和基底细胞均表达4 ，提示4 1 、 5 1 有增加细胞与基质间相互作用，使得腺上皮细胞深入到基质结构中，与异位内膜粘附有关。国内杭爱国等8 用免疫组织化学方法分析了EM患者在位内膜和异位内膜中整合素4 、5 、1 、 3 的表达，结果提示，5 在EM在位内膜的表达显著低于正常子宫内膜。本研究显示整合素5 在体外培养的异位内膜细胞中均有表达，说明整合素5 与EM的发生确实有一定关系。 3.2 性激素对异位内膜细胞中整合素 5 表达的调节 Yoshimura等9 体外试验表明，加E2 和P到培养的人体增殖期子宫内膜可使子宫内膜整合素1 表达增强。国内也有研究表明，孕三烯酮和RU486对异位内膜细胞有抑制作用，两者均可诱导异位内膜细胞凋亡10 。本研究结果显示，E2 和P能上调整合素5 mR-NA表达，而雌激素拮抗剂TAM、孕激素拮抗剂RU486则降低整合素5 mRNA表达水平，提示雌、孕激素可能通过改变异位内膜细胞中整合素分子水平而促进异位子宫内膜细胞与盆底腹膜间质细胞间的粘附作用，从而促使异位病灶的形成及发展，而TAM、RU486则可能通过拮抗E2 、P或抑制异位内膜细胞分泌整合素5 分子而延缓EM的发展，从而起到治疗作用。从另一方面也说明EM的发生与盆腹腔局部环境的雌、孕激素水平有关。 总之，整合素5 在EM的发生中起着一定作用，抗粘附治疗为临床治疗EM提供了一个新的途径，有望预防EM的复发和彻底治愈该病。 参考文献 1MATTHEWS C J，REDFERN C P，HIRST B H，et al.Characteriza-tion of human purified epithelial and stromal cells from endometrium and endometriosis in tissue cultureJ.Fertil Steril，1992，57:990.997. 2鄂征.组织培养和分子细胞学技术M.北京:北京出版社，1995.121.128. 3ADACHI M，TAKI T，HIGASHIYAMA M，et al.Significance of in-tegrin 5 gene expression as a prognostic factor in node-negative non-small cell lung cancerJ.Clin Cancer Res，2000，6（1）:96.101. 4HOSHIGA M，ALPERS C E，SMITH L L，et al. 3 integrin ex-pression in normal and atherosclerotic arteryJ.Circ Res，1995，77（6）:1129.1135. 5STARZINSKI-POWITZ A，HANDRAW-METZMACHER H，KOTZI-AN S.The putative role of 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