当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后PTEN的表达及统计分析.doc

当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后PTEN的表达及统计分析【摘要】 目的：探讨当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞PTEN的表达及统计学意义。方法:将35只SD大鼠随机分成4组(n=10):正常对照组(n=5);假手术组(n=10);缺血再灌注组(n=10);当归治疗组(n=10) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色;观察各组动物心肌细胞内PTEN表达的变化。利用HPIAS2000图像分析系统测定PTEN在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性;假手术组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性;缺血再灌注损伤组：心肌细胞内可见大量的棕黄色颗粒沉积，PTEN表达呈阳性;当归治疗组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间PTEN表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01);正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间PTEN表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤导致心肌细胞的凋亡有重要的保护作用。 【关键词】 当归注射液; 缺血再灌注; 心肌; 细胞凋亡; PTEN心肌缺血再灌注损伤( ischemia / reperfusion, I/R), 是指在短时间心肌血供中断, 一定时间内恢复血供, 原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤。随着心脏外科体外循环、冠状动脉搭桥术、复杂先天性心脏病纠治术、及溶栓等治疗的推广应用, 已成为阻碍心血管治疗疗效的主要难题1。近年,中草药在心肌缺血再灌注损伤中的作用受到越来越多的关注, 中草药舒张冠状血管、改善冠脉循环, 减轻氧化损伤等均是其发挥心脏保护作用的重要机制2。当归为伞形科(Umbrelliferae)植物的干燥块根,药性甘、辛、温,入肝、心、脾经, 具有补血活血、调经止痛、润燥滑肠等功效3，4。当归属于和血类药物(指有养血、调和血脉作用的药物) 。近年来，有不少学者对中药预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行了研究与探索。PTEN 基因是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶(DPS) 活性的抑癌基因,该基因在细胞的生长、增殖、迁移和细胞凋亡中具有重要的生物学功能5。本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌细胞内PTEN的表达,探讨当归注射液对心肌缺血/再灌注损伤的作用机理。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物模型制备及分组 选用健康雄性Wistar大鼠(SPF级)35只,体重250300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg(100 g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸呼吸频率60 次min-1, 潮气量2ml(100g)-1,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组: 正常对照组(不做任何处理);假手术组(丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎);缺血再灌注损伤组(IR)( 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ,再灌注120 min );当归注射液预处理组(在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/ kg , 其它处理同缺血/ 再灌注组)。1.2 主要试剂25%当归注射液(武汉大学中南医院制药厂);即用型兔抗鼠Bim多克隆抗体，即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。1.3 方法1.3.1 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。1.3.2 免疫组织化学SP法检测PTEN相关抗原 主要步骤：5m组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，Ki67均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。1.4 免疫组织化学结果判断PTEN以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对PTEN抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。1.5 统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准为0.05。2 结果PTEN的表达 正常对照组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性;假手术组：心肌细胞内可见少量棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性;缺血再灌注损伤组：心肌细胞内可见大量的棕黄色颗粒沉积，PTEN表达呈阳性;当归治疗组：心肌细胞内可见少量和未见棕黄色颗粒，PTEN表达呈阴性。图像分析结果显示：正常对照组：PTEN表达的平均光密度为0.19250.0011，假手术组：PTEN表达的平均光密度为0.20130.0024，缺血再灌注损伤组：PTEN表达的平均光密度为0.89740.0086;当归治疗组：PTEN表达的表达的平均光密度为0.21830.0038;正常对照组：PTEN表达的阳性面积率为0.20380.0023，假手术组：PTEN表达的阳性面积率为0.21590.0026，缺血再灌注损伤组：PTEN表达的阳性面积率为0.96310.0077;当归治疗组：PTEN表达的表达的阳性面积率为0.24850.0048。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P<0.05)。经q 检验，正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间PTEN的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01);正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间PTEN平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。表1 当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组PTEN表达的平均光密度和阳性面积率注：* 正常对照组、假手术组、当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较，P<0.001; 当归治疗组、假手术组与正常对照组比较，P>0.05。3 讨论近年来,心血管疾病已成为威胁人类生命的主要原因,而心肌梗死的发病率亦呈上升趋势。众所周知,早期溶栓治疗是心肌梗死较为理想的治疗手段,它可以挽救缺血的心肌细胞,减少梗死面积,改善心脏功能。但溶栓造成的再灌注损伤也愈来愈引起临床医务工作者的关注。长时间心肌缺血可造成组织损伤和细胞死亡,早期的再灌注可挽救缺血组织,但仍能造成细胞继续死亡,这种再灌注给组织带来的负性影响被称为再灌注损伤6。动物实验发现,于大鼠短暂缺血30min后进行观察,未见凋亡细胞数量增多。而再灌注240min于缺血的左室壁,发现有大量的心肌细胞凋亡出现。证实存在再灌注心肌细胞的损伤,且在短暂缺血后再灌注心肌细胞死亡主要为细胞凋亡。提示心肌细胞凋亡是心肌再灌注损伤的特征之一,可能与再灌注心肌迟发性死亡密切相关7,8。当归是传统中药,可对缺血心脏冠脉血管有明显的扩张作用,促进心肌侧枝循环的建立,改善心肌血流分布,减轻因缺血再灌注引起的细胞结构的改变。研究发现, 当归对细胞凋亡有防治作用。在再灌注前给药,可明显减少再灌注引起的细胞凋亡,并证明当归对心肌缺血的保护点在再灌注期,这将当归的研究提高到分子生物学水平9，10。PTEN 基因全长200 kb ,有9个外显子,mRNA长度为5.5 kb ,cDNA 序列内有一个由1209 个核苷酸组成的开放阅读框,编码由403个氨基酸残基组成蛋白。免疫荧光显示,PTEN 蛋白定位于胞浆中,具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性,能使某些磷脂或蛋白激酶相应位点去磷酸化,抑制细胞周期的运行,介导细胞凋亡,并调控细胞的黏附、迁移和分化1113。PTEN 因其独特的作用途径而倍受关注,它作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,具有抑制生长、促进凋亡、参与细胞周期的调控、抑制血管生成及抑制细胞黏附和转移的作用14，15。本实验数据表明: 正常对照组：PTEN表达较低;假手术组：PTEN表达较低;缺血再灌注损伤组：PTEN表达高;当归治疗组：PTEN表达较低。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间PTEN表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01);正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间PTEN表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05) 。实验结果提示: 心肌I/ R 损伤可诱发心肌细胞凋亡, 当归能对缺血心脏冠脉血管有明显的扩张作用,促进心肌侧枝循环的建立,改善心肌血流分布, 可明显减少再灌注引起的细胞凋亡，对心肌细胞起了重要的保护作用。【参考文献】 1 杨勇, 贾国良. 左旋卡尼汀对培养乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤的保护作用.第四军医大学学报, 2004, 25 (2) : 134137.2 李贵荣,吕昌银,杨胜圆. 当归多糖清除活性氧自由基作用的研究. 南华大学学报, 2002,16(3):1820.3 陈江弘,杨崇仁.当归属植物的研究进展.天然产物研究与开发,2004 ,16 (4): 359365.4 李用珍,刘彩红,董红军.当归化学成分研究.实用中医药杂志,2004 ,20(2):105106.5 陈国庭, 尹浩然, 朱正刚. 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