急性颅脑外伤后局部脑组织热休克蛋白70的表达.doc

急性颅脑外伤后局部脑组织热休克蛋白70的表达【摘要】 目的探讨人颅脑外伤后伤灶周围神经细胞中热休克蛋白70(HSP70)的表达及其与损伤时间的关系。方法采用免疫组织化学技术检测58例颅脑外伤患者伤后72 h内局部脑损伤区神经细胞中HSP70表达。结果伤后6 h HSP70已出现阳性表达,24 h达高峰,至72 h仍呈较高水平;GCS7分组HSP70表达显著高于GCS8分组(P<0.05),存活组表达显著高于2周内死亡组(P<0.05)。结论HSP70在急性颅脑损伤后不同程度表达增强,并具时相规律性。 【关键词】 脑损伤 热休克蛋白质70 免疫组织化学 人类 自20世纪80年代以来,热休克蛋白70(heat shock protein70, HSP70)作为维持机体自身稳定性的应激蛋白,日益受到人们注目。在创伤所致应激反应过程中HSP70的表达及其保护作用的研究方兴未艾。目前国内绝大多数研究仍然是建立在实验动物模型上12。笔者采用免疫组织化学方法检测自2001年11月2005年6月58例不同程度急性颅脑外伤患者局部伤灶标本中脑神经细胞HSP70表达情况,探讨它们与损伤时间的关系。 1对象与方法 1.1对象随机选取急性颅脑外伤手术患者58例,男性41例,女性17例,年龄(45.112.3)岁(1476岁);其中合并颧骨骨折6例，下颌骨骨折3例，前臂骨折2例，肾挫伤1例。所有患者均无低血压休克史,无感染发热史。患者受伤部位均为额颞顶部,因严重挫裂伤和/或硬膜下血肿急诊行开颅手术。受伤至手术时间372 h。按格拉斯哥昏迷评分法(GCS)分为7分组(32例)及8分组(26例)。存活38例(存活组),2周内死亡20例(死亡组),死因为脑干功能衰竭。 1.2方法切取损伤区周边损伤脑组织少许(术前均征得患者家属同意,并签定知情同意书),室温下立即置于体积分数为0.01甲醛溶液中固定24 h,常规石蜡包埋后制成5 m厚连续切片备用。另选非神经系统疾病猝死7例(对照组),男性5例,女性2例,年龄(36.419.3)岁(1168岁),标本取自额颞部。 免疫组织化学染色采用链霉抗生物素蛋白过氧化物酶联结法(SP法),SP试剂盒及一抗(鼠抗人)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。 1.3结果判定以细胞核和/或细胞质内棕褐色沉淀为阳性细胞。在显微镜下,随机计数100个神经细胞,以其中的阳性细胞数除以100,得出HSP70阳性细胞百分率。多功能真彩色病理图像分析系统(CMIAS007型,北京航空航天大学设备厂)对HSP70阳性细胞进行计数,求出每平方微米(m2)单位面积中阳性细胞数。 1.4统计学处理数据以xs表示。采用SPSS 12.0 软件包进行统计分析,组间比较采用Independentsampeles t test。 2结果 对照组神经细胞中几乎未见HSP70阳性表达,脑外伤组伤灶周围神经细胞质或细胞核中均可见HSP70阳性表达(图1)。 A:对照组;B:脑外伤后72 h. 图1脑外伤后72 h神经细胞HSP70阳性表达(SP法 100) Fig 1The expression of HSP70 in neural cells following traumatic brain injury 脑外伤组不同时相HSP70阳性细胞百分率和单位面积中阳性细胞数均高于对照组(P<0.01);伤后6 h在伤灶周围神经细胞中HSP70表达已呈阳性,24 h表达最多,随后逐渐降低,至72 h仍有较高水平表达;存活组表达明显高于死亡组(P<0.05,表1)。表158例脑外伤热休克蛋白70免疫组织化学染色比较与对照组比较,:P<0.01;与死亡组比较:,:P<0.05. 3讨论 HSP70是组织细胞在热环境中或应激条件下产生的一种相对分子质量约70 kD的蛋白质,具有高度保守性和诱导生成普遍性,能提高细胞对应激原的耐受性1。组织细胞在遭受应激刺激后,HSP基因被变性蛋白激活,诱导产生一组应激蛋白。大多数生物细胞应激反应后HSP70出现显著改变,其主要功能是促进新生多肽链的正确折叠,对分子重排、蛋白质解聚和新生多肽的跨膜运输也具有重要 的辅助作用。HSP70广泛存在于正常细胞和肿瘤细胞的细胞质、高尔基体、内质网、核及核仁中,起着多种分子伴侣的作用,参与多种细胞内蛋白的折叠、装配及转运,行使“看家”功能24。 脑挫伤后HSP70阳性细胞最早出现的时间各家报道不一。最早在伤后30 min脑挫伤灶周围即有HSP70的表达5;而Truettner等在液压冲击脑损伤模型中显示损伤灶及其周围细胞质中4 h开始出现HSP70 mRNA6。Dutcher等对创伤性脑损伤患者挫伤的脑皮质进行Northern及Western杂交分析,发现伤后46 h HSP70 mRNA达到高峰,24 h恢复正常;伤后1220 h HSP70蛋白达到高峰。免疫组织化学显示,伤后12 h HSP70在神经元内阳性表达2。笔者曾研究显示,伤后6 h内伤灶周围神经细胞中HSP70已呈阳性表达,其阳性细胞百分率和单位面积中阳性细胞数均显著高于尸检对照组(P<0.01),24 h阳性表达最多,与文献报道基本一致23;随后HSP70表达逐渐降低,直至72 h仍有较高水平表达。以往文献报道均未涉及伤后72 h的表达情况47,但本研究中伤后72 h与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01)。笔者推测可能原因有三:与原发损伤后再缺血有关;神经细胞受损程度及耐受性不同;取自不同损伤区域神经元其表达不同。Gilby等在大鼠实验研究中发现,HSP70在受伤后神经细胞中存在分阶段表达的现象7。由于该时相组例数太少,无法更多了解损伤后72 h HSP70表达情况;且缺乏伤后超早期(<2 h)的标本,有待今后进一步研究。 HSP70在组织细胞损伤的过程中表达增强,对细胞具有保护作用,是内源性细胞保护因子,同时也能反映细胞损伤的程度。笔者研究证实,GCS7分组的HSP70表达明显地高于GCS8分组(P<0.05)3,说明细胞损伤程度不同,应激反应强度也不一样,HSP70蛋白表达随损伤的增加而表达增强。存活组的HSP70表达明显高于2周内死亡组(P<0.05),说明损伤局部脑组织中 HSP70表达是外伤后局部神经细胞反应性的一种表现,对受损神经细胞的功能修复和损伤程度的减轻可能具有一定的作用。但当神经元损伤超过其自身修复代偿能力时,其表达水平则随损伤程度的增加而减少,提示损伤可能非不可逆性。笔者认为,颅脑外伤后HSP70的表达是脑组织在基因水平的一种自身保护性机制,其表达水平在一定程度上可作为评估颅脑伤情的临床参考指标之一。【参考文献】 1闫东明,张志强,宋来君,等. 右美沙芬治疗对兔急性脑外伤保护作用的研究J. 中华创伤杂志, 2002,18(10):596598.2Dutcher S A,Underwood B D,Walker P D,et al. Patterns of heatshock protein 70 biosynthesis following human traumatic brain injuryJ. J Neurotrauma, 1998,15(6):411420.3陈峻严,黄金钟,黄种心,等. 颅脑外伤后局部脑组织HSP70基因的表达J. 中华创伤杂志, 2006,22(8):623624.4林章雅,康德智,连葆强,等. 高表达热休克蛋白70鼠脑胶质瘤细胞瘤苗的体内抗瘤作用J. 福建医科大学学报, 2005,39(4):373375.5王慧君,饶广勋,朱少华,等. HSP70、NF应用于脑挫伤时间推断的实验研究J. 法医学杂志, 2000,16(3):132134.6Truettner J S,Hu B,Alonso O F,et al. Subcellular stress response after traumatic brain injuryJ. J Neurotrauma,2007,24(4):599612.7Gilby