猪流行性腹泻病毒M蛋白B细胞表位预测分析.doc

猪流行性腹泻病毒M蛋白B细胞表位预测分析 作者：王珅，高慎阳，周铁忠，毕聪明【摘要】 目的 分析TGEV M蛋白的B细胞表位,为试验确定TGEV M蛋白的B细胞表位和开发TGEV重组亚单位疫苗研究奠定基础;方法 以TGEV M蛋白氨基酸序列为基础,分别采用Garnier-Robson、Chou-Fasman和Karplus-Schulz 方法预测M蛋白的二级结构，以及利用在线TMHMM Server v2.0软件分析M蛋白的跨膜区;之后，分别按Kyte-Doolittle，Emini和Jameson-Wolf 方案预测TGEV M蛋白的B细胞表位;结果 预测结果表明,在TGEV M蛋白N端共同-螺旋区段为4个;共同的-折叠区段分别为13个;共同的转角区域分别为7个;柔性区域为12个;M蛋跨膜区3个;结论 TGEV M 蛋白N端第1943、103109、138155、198205、220228和237257区段内或附近很可能是B细胞表位优势区域。 【关键词】 TGEV;M蛋白;B细胞表位Abstract: Objective To identify the potential B cell epitopes of M protein of TGEV in theory, which is helpful for the development recombinant subunit vaccine of TGEV. Methods The secondary structure of M protein of TGEV and its transmembrane region were predicted by the methods of Garnier-Robson, Chou-Fasman, Karplus-Schulz and TMHMM Server v2.0 software online respectively, based on its amino acids sequence. And hydrophilicity plot, surface probability plot and antigenic index for M protein were analyzed by the methods of Kyte-Doolittle, Emini and Jameson-Wolf methods, respectively. Results There are 4 centers of -helix, 13 centers of -sheet, 7 turn regions, 12 flexible regions, and 3 TMs in the M proteins N terminal, respectively.Conclusions Combined the previous results, the B cell epitopes for M protein of TGEV were predicted, which the B cell epitopes possibly localized in or nearby the M proteins N terminal No. 1943,103109，138155，198205，220228 and No. 237257.Key words:TGEV; M protein; B cell epitope猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE) 是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。各种年龄的猪均可发病，尤其以新生仔猪危害最为严重。TGEV最早于1946年被证实，该病毒为冠状病毒科成员，其核酸为单股正链RNA，大小为2.86104bp，分子质量为6103ku，分为7个区，每个区有一个或多个开放阅读框，其编码的主要结构蛋白有4种，分别为核蛋白(N)、膜蛋白(M)、糖蛋白(S)、小膜蛋白(sM)，其中以S糖蛋白分子量最大，其结构与功能方面的研究也最为深入，M蛋白含量最高，是跨膜糖蛋白,在病毒装配及出芽过程中发挥重要作用1。序列分析表明不同毒株之间M蛋白氨基酸序列极为保守，同源性达97.2%，且有关研究发现M膜蛋白N、C两端均具有免疫优势,可考虑与S蛋白N端抗原位点联合作为保护性抗原成分开发TGEV重组亚单位疫苗2-4。为此，本文通过对TGEV M蛋白的B细胞表位进行预测分析,为疫苗设计提供基础参考资料。1 材料和方法1.1 TGEV M蛋白氨基酸序列以Purdue株为参考，检索自蛋白质数据库SwissProt,检索编号为P04135，其M蛋白共有262个氨基酸残基。1.2 M蛋白的二级结构预测分析应用DNASTAR软件中的Protean模块分析，以其内引的Garnier-Robson 方法即计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性，Chou-Fasman 方法即通过序列氨基酸残基的晶体结构来预测蛋白质二级结构和Karplus-Schulz 方法即预测蛋白质骨架区的柔韧性，来综合预测蛋白质的二级结构,详见参考文献5-8;利用在线TMHMM Server v2.0软件对M蛋白的跨膜区进行分析。1.3 M蛋白的B细胞表位预测分析按Kyte-Doolittle 的氨基酸亲水性标准(以7个氨基酸残基为一组的方案)预测M蛋白亲水性;按Emini方案预测蛋白质的表面可及性;按Jameson-Wolf方案预测抗原性指数。各方案参数祥见参考文献9-11。2 结 果2.1 TGEV M蛋白的二级结构预测分析结果Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测的结果不尽相同(见图1),其中预测的共同-螺旋区段为分别在TGEV M蛋白分子N端第1724，186192，222225和253262;共同的-折叠区段为1012，5969，7680，8588，96101，107117，123142，157159，167169，177181，206209，214219和233237;共同的转角区域为3133，3537，4345，5658，7071，143146和152153。Garnier-Robson 方法预测的无规卷曲区域为7274，103105，147151，184185和240242(见图1)。此外，Karplus-Schulz 方法预测的柔性区域为 2328，3039，4346，7274，141145，150154，171176，183185，200203，211214，221230和237257(见图1)。利用在线TMHMM Server v2.0 对TGEV M蛋白的跨膜区分析显示(见图2)：M蛋白跨膜3次，即4769、7698和113135区段;而146和99112区段位于膜外区，7075和136262区段位于膜内区。2.2 TGEV M蛋白的B细胞表位预测结果按Kyte-Doolittle 的氨基酸亲水性标准,预测TGEV病毒M蛋白分子N端第1943、7177、103110、138152和224258区段为高亲水性区域,见图3。按Emini方案预测氨基酸残基位于蛋白质的表面可及性,提示M 蛋白N端第2326、3334、7175、103109、139145、148152、199201和235257区段很有可能位于蛋白质的表面,见图4。按Jameson-Wolf方案,TGEV M 蛋白分子N端第1446、7075、103109、138155、198205、220228 和237258 区段为抗原性指数较高的区域,见图5。此外，我们对TGEV国内参考株如HN2002、TS等的M蛋白进行了如上述分析，其结果与Purdue株TGEV M蛋白的相关分析结果相近(附图略)。在综合分析上述各项预测结果的基础之上，我们初步判定TGEV M蛋白N端第1943、103109、138155、198205、220228 和237257区段是有效的B细胞表位。3 讨 论由于3个软件编制原理和计算方法的不同，按Garnier-Robson方法，Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法所预测蛋白质的二级结构有所不同。但Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的预测结果均提示TGEV M 蛋白分子内部富含-螺旋区段4 个,-折叠区段13 个,转角区域7个以及多个无规则卷曲区域和柔性区域，这些区域的附近或内部很可能分布着B细胞表位。经Kyte-Doolittle方案，Emini方案和Jameson-Wolf方案预测结果进一步综合分析得出,TGEV M蛋白N端第1943、103109、138155、198205、220228和237257区段很可能是有效的B细胞表位。其中C端的220228和237257区段B细胞表位分析结果与Risco,C(1955)鉴定的PUR46-MAD株TGEV M蛋白C端的217262区域内存在抗原位点结论相符，而且该毒株TGEV M蛋白C端较长的尾部既存可存在于膜内区也可存在于膜外区(见图6)，然而其他TGEV毒株M蛋白是否也存在此种情况尚未确定35269-5277。因此，有必要将各株TGEV M蛋白的有效抗原位点筛选出来为其单克隆抗体和疫苗的制备提供基础资料。在M蛋白序列比较分析研究中，发现TGEV各毒株间M蛋白的二级结构和B细胞抗原表位非常稳定,提示以该蛋白为研究对象对TGE防治或检测具有普遍意义。蛋白质分子中构成有效抗原表位与其肽段是否位于蛋白表面,亲水性和机体免疫状态等多方面因素有关。本文是基于M蛋白线性氨基酸序列性质的预测分析,对氨基酸残基之间力的相互作用分析不足,所以对构象性表位预测有一定的局限性。但通过对TGEV M蛋白的候选表位进行初步筛选后缩小了研究范围,即TGEV M蛋白N端第1943、103109、138155、198205、220228和237257区段为重要的潜在B细胞表位，尤其1943、220228和237257区段内可能具有保护性抗原表位的序列，但最终实际应用效果仍须通过实验结果来确认。总之，以上研究结果为TGEV M蛋白单克隆抗体的制备及重组亚单位疫苗的设计提供参考线索。【参考文献】 1 殷震，刘景华.动物病毒学M.第2版.北京：科学出版社，1997：681-688.2 Lai MMC ,Cavanagh D. The molecular biology of coronavirusesJ. AdvVirus Res ,1997 ,48: 1-100.3 Cristina R ，Ines M A ，Carlos S ，et al.Membrance protein molecules of t ransmissible gast roenteritis coronavirus also expose the carboxy-terminal region on the external surface of the viron J.J Virol,1995,69(9):5269-5277.4 Siddell SG. The CoronaviridaeM. New York:Plenum Press,1995：115-139.5 Garnier J ,Osguthorpe DJ ,Robson B. Analysis of the accuracy and implications of simple method for predicting the secondary structure of globular proteinsJ.J Mol Biol,1978,120:97-120.6 Chou PY，Fasman GD. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequenceJ.Adv Enzymol,1978,47:45-48.7 Chou PY. Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein ConformatioM. New York:Plenum Press,1990：549-586.8 Karplus PA,Schultz GE. Prediction of chain flexibility in proteinsJ. Naturwissenschaften,1985,72 :212-213.9 Kyte J ，Doolittle RF. A simple method for displaying the hydropathic character of a proteinJ. J Mol Biol,1982,157:105-132.1