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端粒酶在面突外胚间充质细胞干细胞中的表达 作者：邓蔓菁 金岩 史俊南 董蕊 何大为 【关键词】 外胚间充质干细胞Expression of human telomerase in ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process【Abstract】 AIM: To evaluate the activity of telomerase in ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process. METHODS: Ectomesenchymal stem cells of early human embryonic facial process were isolated and cultured in undifferentiated conditions by supplementing with leukemia inhibitor factor (LIF). Immunohistochemistry assay and image analysis were used to detect the expression extent of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) when cells were passaged for 1, 8, 15 and 22 times. Cells without LIF for 10 days were also evaluated. RESULTS: Ectomesenchymal stem cells expressed hTERT. The expression extent of hTERT decreased with the increasing times of passages. The differentiated cells didnt express hTERT. CONCLUSION: Though ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process have somewhat high telomerase activity, the telomerase activity at this level is not enough to prevent cells from senescence.【Keywords】 ectomesenchymal stem cell； human telomerase reverse transcriptase【摘要】 目的： 探讨面突外胚间充质干细胞的端粒酶活性状况. 方法： 体外培养妊娠50 d人胚胎面突外胚间充质干细胞，白血病抑制因子（LIF）抑制细胞分化，于第1, 8, 15和第22代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达并进行图像分析，同时检测无LIF抑制下，第5代细胞自发分化10 d端粒酶逆转录酶的表达情况. 结果： 外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶，表达强度随传代次数的增多而下降. 在分化状态，该细胞不再表达端粒酶逆转录酶. 结论： 早期胚胎面突外胚间充质干细胞具有较高的端粒酶活性，但不足以抑制该细胞的衰老.【关键词】 外胚间充质干细胞； 端粒酶逆转录酶0引言端粒酶在胚胎干细胞、生殖细胞、永生化细胞及大部分肿瘤细胞中表达，但在正常体细胞中一般不表达. 近来发现胎儿组织、正常人的骨髓干细胞等也不同程度地表达端粒酶1-3. 这表明更广泛的组织细胞可能存在端粒酶活性. 为了解面突外胚间充质干细胞作为多种终末细胞的来源细胞4,5，端粒酶是否有活性，表达的端粒酶是否可以阻止衰老的发生，我们通过检测与端粒酶高度相关的端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的表达，获取面突外胚间充质干细胞端粒酶表达的信息.1材料和方法1.1材料DMEM（低糖）/F12培养基、胎牛血清(FBS)、非必须氨基酸（NEAA）(Gibco, USA)；白血病抑制因子（leukemia inhibitor factor， LIF）（Chemicon, USA）；抗HNK1 mAb, 抗hTERT多抗(Santa Cruz Bio，USA)；抗波形丝蛋白mAb（Vimentin）, LSAB免疫组化检测试剂盒（DAKO, USA）.1.2方法 面突外胚间充质干细胞的培养和鉴定： 50 d因外伤流产自愿捐赠的胚胎，切取上下颌突，分切为1 mm3大小， 2.5 g・L-1胰酶37消化20 min，血清中和，吹散，离心. 再悬并以1106接种于100 mL培养瓶中，培养液为含100 mL・L-1 FBS, 0.1 mol・L-1 NEAA的DMEM/F12(11)，并添加1106 U・L-1的白血病抑制因子（ LIF），以使细胞保持未分化状态. 孵箱内静置50 min，约50%细胞贴壁，弃培养液，添加新培养液. 间充质细胞贴壁速度较上皮细胞贴壁快，利用其贴壁时间的差异进行初步分离，去除部分上皮细胞. 细胞长满90%时，弃培养液，加入2.5 g・L-1胰酶. 间充质细胞对胰酶的耐受性较差，先脱壁，而上皮细胞脱壁需要的时间较长. 将消化下来的细胞置于培养瓶中，12传代，再次利用贴壁时间的差异分离上皮和间充质. 最初3代以12传代，并在消化和传代时分离上皮细胞. 从第4代开始，以13传代，并不再分离上皮. 免疫组化抗HNK1, Vimentin染色阳性鉴定细胞为外胚间充质干细胞； 免疫组化检测及图像分析： 细胞传代时，于第1, 8, 15及第22代制备细胞爬片；同时，将第5代细胞培养于无LIF的培养液中，10 d后爬片. PBS 洗，40 g・L-1多聚甲醛固定后，按免疫组化检测试剂盒的程序进行抗hTERT染色. 每个样本随机选择30个细胞，利用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统检测阳性细胞的平均灰度值. 同时以舌癌Tca8113细胞系为阳性对照，胎儿皮肤成纤维细胞为阴性对照.统计学处理：采用SPSS统计软件进行统计学分析（方差分析）.2结果 细胞生长情况：面突外胚间充质干细胞在条件培养液中生长良好，约34 d传代1次. 培养至15代以后，细胞增殖速度减慢. 传至第23代，细胞不再增殖； 外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶（hTERT）：外胚间充质干细胞hTERT染色呈阳性，以第1、第8代着色明显（图1A，B），第15代着色较淡（图1C），第22代几乎不着色. Tca8113着色明显（图2）. 第5代细胞培养于无分化抑制剂LIF中10 d后，细胞不再表达端粒酶逆转录酶； 图像分析结果：细胞着色灰度值随传代的增多而变大，各组细胞灰度值分别为：第1代154.97.5，第8代173.48.5，第15代190.27.9，第22代、自发分化10 d和阴性对照组细胞未见着色，灰度值为参照值220，Tca8113 143.89.9. 第1, 8, 15代组间比较有显著差异（P<0.001）. 各组与阳性对照Tca8113比较也有显著差异（P<0.001）. 注：灰度值越大，阳性程度越低.3讨论我们发现，妊娠50 d胚胎面突外胚间充质干细胞有较强的端粒酶活性. 在分化抑制剂LIF作用下，该细胞能保持较强的增殖活力. 第8代细胞的端粒酶逆转录酶hTERT较第1代有下降，但表达较强，肉眼无法判断着色的差异. 第15代细胞仍表达hTERT，但着色程度明显弱于第1代和第8代. 随后细胞的增殖能力开始明显下降，hTERT的活性有较大程度下降，至第22代，细胞几乎不再增殖，而此时细胞不再表达hTERT. 表明hTERT可能对维持细胞A：第1代；B：第8代；C：第15代.图1图2(略)的增殖起作用，而这种作用可能是通过端粒酶活性来实现的. 去除白血病抑制因子LIF后，细胞出现明显的自发分化现象，细胞体积变大，形态多样，增殖速度变慢. 去除LIF 10 d，无法检测到hTERT的表达. 表明干细胞的特性已完全丧失. 与舌癌Tca8113细胞系比较，外胚间充质干细胞的端粒酶活性较低.外胚间充质干细胞表达端粒酶活性，表明此时细胞仍处于未分化状态，比较幼稚，生命周期较长. 但随着培养时间延长，细胞的增殖能力逐渐减弱，端粒酶的活性也逐渐丧失. 二者呈现某种程度的一致性. 推测，在这个过程中，端粒的长度也在逐渐变短. 对胚胎干细胞的研究发现，在条件培养基中，胚胎干细胞可以长期保持未分化状态，端粒酶保持高水平表达，细胞呈现无限增殖活力，无衰老迹象6. 而面突外胚间充质干细胞则不能维持端粒酶的高活性，细胞增殖到一定程度就会出现衰老，最后停止生长. 细胞的衰老、端粒酶活性的降低可能与细胞逐渐分化相关. 这与分化10 d后细胞不表达hTERT相一致. 推测，在目前的条件培养液中，外胚间充质干细胞并不能完全保持其未分化状态，随培养时间的延长，逐渐丧失干细胞的特性.本结果表明，面突外胚间充质干细胞的增殖、分化能力与端粒酶的活性保持一致. 但这种端粒酶活性并不能维持该细胞的无限增殖，随着细胞的增殖、分化会逐渐丧失，或者互为因果.【参考文献】1 Broccoli D, Young JW, de Lange T. Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells J. Proc Natl Acad Sci USA, 1995;92(20):9082-9086.2 Counter CM, Gupta J, Harley CB, Leber B, Bacchetti S. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies J. Blood, 1995;85(9):2315-2320.3 Hiyama K, Hirai Y, Kyoizumi S, Akiyama M, Hiyama E, Piatyszek MA, Shay JW, Ishioka S, Yamakido M. Activation of telomerase an human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells J. J Immunol, 1995;155(8):3711-3715.4 Deng MJ, Jin Y, Shi JN，Lu HB, Liu Y, Zhao Y. Induced differentiation of ectomesenchymal cells of Balb/c fetal mice mandibular process to smooth muscle cells by TGFand rhBMP2 J. Yati Yasui Yazhou Bing Xue Zazhi (Chin J Conserv Denti), 2002;12(10):584-587.5 Deng MJ, Jin Y, Shi JN，Lu HB, Liu Y, Zhao Y. Induced differentiation of ectomesenchymal cells of Balb/c mice fetal mandibular process t