糖蛋白A34在胃癌演变过程中表达的变化.doc

糖蛋白A34在胃癌演变过程中表达的变化【摘要】 目的： 探讨糖蛋白A34在胃癌演变过程中的表达情况及临床意义。方法： 采用RTPCR方法分别检测18例正常胃黏膜（A组）、30例慢性萎缩性胃炎胃黏膜（B组）、24例早期胃癌黏膜组织（C组）及48例进展期胃癌黏膜组织（D组）中糖蛋白A34 mRNA的表达情况。免疫组化法检测各组糖蛋白A34的表达情况。结果： 糖蛋白A34 mRNA在正常组织、萎缩性胃炎组织、早期胃癌组织和进展期胃癌组织中相对表达水平分别为0.0930.010, 0.2110.023, 0.2580.017, 0.2590.021,糖蛋白A34在各组表达阳性率分别为5.56%, 33.33%, 70.83%, 75.00%。糖蛋白A34及其mRNA的表达在A，B，C 三组之间差异均具有统计学意义(P<0.05)，早期胃癌和进展期胃癌两组之间差异无统计学意义(P0.05)。结论： 糖蛋白A34在胃癌的演变过程中的表达逐渐加强。 【关键词】 胃癌； 糖蛋白A34； 逆转录聚合酶链反应； 免疫组化 Abstract Objective: To investigate the expression of glycoprotein A34 in the development of gastric carcinoma and discuss their relations with clinical significance.Methods： The expression of glycoprotein A34 mRNA and protein was detected by RTPCR and immunohistochemical technique in 18 healthy volunteers(group A),30 patients with chronic atrophic gastritis(group B)， 24 patients with early gastric carcinoma(group C)，and 48 patients with advanced gastric carcinoma(group D). Results： The expression of glycoprotein A34 mRNA were 0.0930.010, 0.2110.023, 0.2580.017 and 0.2590.021, in normal, chronic atrophic gastritis, early gastric carcinoma and advanced gastric carcinoma respectively.The positive rate of glycoprotein A34 were 5.56%, 33.33%, 70.83%, 75.00%, respectively.There were statistical difference among group A, B and C(P<0.05) and no statistical difference between group C and D(P0.05). Conclusion： The expression of glycoprotein A34 were enhanced gradually during the course of early gastric cancer being developed. Key words gastric carcinoma； glycoprotein A34； RTPCR； immunohistochemistry 胃癌(gastric carcinoma)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其预后与诊断时的临床分期密切相关。胃癌的形成是一个多阶段、多步骤的复杂过程。胃癌前期病变与胃癌的发生关系，日益受到人们的重视。近几年来国内外学者正深入到胃癌及其癌前病变的分子生物学领域，以寻找特异性指标，作为早期或超早期诊断的手段13。糖蛋白A34（glycoproteinA34，GPA34）是最近发现的一种具有较高组织专一性的细胞表面蛋白，在正常组织中的表达仅限于胃和睾丸4，但其在胃癌演变过程的变化尚未被发现，本研究旨在观察GPA34在胃癌演变过程中的表达变化。 1 材料与方法 1.1 标 本 选用我院胃镜室2007年9月2008年3月间胃镜下活检标本共48例,包括正常胃黏膜组织18例（A组）和慢性萎缩性胃炎患者的胃黏膜组织30例（B组），我院普外科2007年9月2008年3月间手术的胃癌患者癌组织72例，其中早期胃癌黏膜组织24例（C组）及进展期胃癌黏膜组织48例（D组），所有病例均经病理确诊。所有病例均未接受抗肿瘤治疗。新鲜组织离体后迅速放入液氮中保存备用。 1.2 RTPCR 1.2.1 组织标本总RNA的提取 严格按照Trizol Reagent 试剂盒说明书提取组织总RNA, 核酸蛋白检测仪测定所提取标本RNA的浓度和纯度，并计算其含量。 1.2.2 逆转录 RTPCR试剂盒购于TaKaRa大连宝生物公司，其余试剂均购自天根生化科技有限公司。取每份标本的总RNA 2g 进行逆转录反应，反应体系共20 l：MgCl2 4 l，10RT 缓冲液2 l，去RNA酶dH2O 7.5 l，dNTP混合物（各10 mmol/L）2 l，RNA酶抑制剂0.5 l，AMV反转录酶1 l，Random 9 mers 1 l，RNA 2 l。混匀后按以下条件进行逆转录反应：30 10 min，42 30 min， 99 5 min，5 5 min。终止反应，将逆转录终产物cDNA以14稀释后置-20保存备用。 1.2.3 聚合酶链反应 根据基因库提供的GPA34的mRNA序列，应用Primer 5.0设计引物。PCR反应条件：95 5 min， 95 30 s，57.9 30 s，72 1 min，30个循环, 72 5 min。序列见表1。表1 RTPCR 引物序列 1.2.4 结果判定 取10 l上述PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳成像拍照并用Kodak D3.5专用软件进行图像分析。将目的条带的积光光密度与内参照GAPDH条带积光光密度比值作为产物的相对表达量。对每1份标本均进行复管检测，取其均值作为GPA34 mRNA表达水平。 1.3 免疫组织化学染色 1.3.1 主要试剂 鼠抗人GPA34单克隆抗体购自Cell Sigaling公司,免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司. 1.3.2 采用ABC法（抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合物）进行免疫组化染色 组织切片经二甲苯脱蜡、乙醇水化后，浸入3 ml/L的过氧化氢中30 min，以阻断内源性过氧化酶的活性，然后将玻片置入0.01 mol/L，pH6.0的柠檬酸缓冲液中加热30 min，以充分暴露抗原，分别滴加鼠抗人GPA34单抗，4孵育过夜，再滴加第二抗体，室温下反应20 min，过氧化酶反应15 min。随后经二氨基联苯胺四盐酸盐显色5 min，再经苏木素复染，脱水、透明、封片。每次染色均以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。 1.3.3 结果判定 GPA34定位于细胞膜,以胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。由两位病理医师采用双盲法观察每张切片,根据以下2个方面判断阳性反应。按切片中显色细胞数比例计分：0分为无细胞显色；1分为显色细胞占细胞总数<25%；2分为显色细胞占细胞总数的25%50%；3分为显色细胞超过切片中细胞总数的50%。按切片中细胞显色强度计分：0分为细胞无显色；1分为呈浅黄色；2分为呈棕黄色；3分为呈棕褐色。+>3分记为阳性,3分记为阴性。 1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行分析。GPA34 mRNA 表达水平采用单因素方差分析及样本均数两两比较的q检验(NewmanKeuls 法)；GPA34蛋白表达进行2检验（Fishers精确概率检验）。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 RTPCR检测显示GPA34 mRNA平均相对表达量在正常胃黏膜组（A组）、慢性萎缩性胃炎组（B组）、早期胃癌组(C组)、进展期胃癌组（D组）分别为0.0930.010，0.2110.023，0.2580.017及0.2590.021。 A，B，C三组呈逐渐增高趋势，慢性萎缩性胃炎组明显高于正常胃黏膜组（P=0.000），早期胃癌组明显高于慢性萎缩性胃炎组（P=0.000）,差异具有统计学意义。早期胃癌和进展期胃癌两组之间差异无统计学意义(P=0.807)。结果见图1。 免疫组织化学染色显示糖蛋白A34在细胞膜的表达，A，B，C，D组表达阳性率分别为5.56%, 33.33%, 70.83%, 75.00%， A，B，C三组之间差异具有统计学意义(P<0.05)，早期胃癌组、进展期胃癌组之间差异无统计学意义(P0.05)。结果见表2和图2。 表2 糖蛋白A34在各种胃组织中的表达差异 3 讨 论 近10年来对胃癌早期的诊断除依靠影像、内镜、细胞学等检查手段外，现已深入到胃癌的分子生物学领域。多种新技术如免疫组化、单克隆抗体、基因及基因产物表达的检测均已作为胃癌早期诊断的手段1-3。肿瘤标志物指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成、释放或是由宿主对癌类反应而产生的一类物质5。肿瘤标志物在肿瘤的筛选、诊断、预后随访、监护治疗及复发检出中起重要作用。其价值取决于有关标志物的敏感性和特异性。但至今尚未发现敏感性和特异性均十分理想的胃癌标志物，因此寻找和发现新的胃癌标志物是胃癌研究的重要课题之一。 糖蛋白A34（GPA34）在正常组织中的表达仅限于胃和睾丸，属于结合黏附分子家族（junctional adhesion molecule family，JAM），由387个氨基酸组成，分子质量约为5760.5 kDa，包含3个结构域：细胞外结构域由233个氨基酸组成、由23个氨基酸组成的跨膜结构域以及由131个氨基酸组成的细胞内结构域4，但其功能以及在胃癌演变过程中扮演的角色尚不清楚。由于其有着特殊的组织专一性，可望成为胃癌诊断新的生物标记物。 大量研究表明，胃癌的发生是一个涉及多基因改变的多步骤过程。正常胃组织在发生恶性肿瘤之前常经历持续多年的癌前病变。慢性萎缩性胃炎是最常见的胃癌前状态，在胃癌高发区，慢性萎缩性胃炎发病率显著增高。全国各胃癌高发区流行病学调查结果表明，慢性萎缩性胃炎患病率与胃癌病死率之间呈平行关系6。因此，本实验通过研究正常胃组织、慢性萎缩性胃炎组织和胃癌组织中糖蛋白A34的表达来判断其在胃癌演变过程的变化。 本研究发现糖蛋白A34 mRNA在正常组织、萎缩性胃炎组织和早期胃癌组织中相对表达水平分别为0.0930.010, 0.2110.023和0.2580.017,免疫组化显示其蛋白表达阳性率在以上组织中分别为5.56%, 33.33%和70.83%，表达在逐渐增高，3组间差异具有统计学意义(P<0.05)，提示糖蛋白A34作为组织特异性较高的标志物，其量的表达在胃癌的演变过程中逐渐增高，对胃癌的早期诊断具有重要意义。但其在早期胃癌和进展期胃癌之间差异无统计学意义(P>0.05)。 虽然糖蛋白A34在胃组织有较高的组织专一性，初步的研究也表明，其在胃癌的发病过程中有逐渐升高的趋势，但如何确定其升高的阈值作为判断各期病变的标志尚有待于进一步研究。【参考文献】 1 Kim CJ, Cho YG, Park CH,et al.Genetic alterations of the MYH gene in gastric cancerJ.Oncogene,2004,23(40):6820-6822.2 Li VS, Wong CW, Chan TL,et al.Mutations of PIK3CA in gastric adenocarcinomaJ.BMC Cancer,2005,5:29-34.3 Van Kouwen MC,Drenth JP,Oyen WJ,et al.18FFluoro2deoxyDglucose positron emission tomography detects gastric carcinoma in an early stage in an asymptomatic Ecadherin mut