红花对肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用.doc

红花对肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用 作者：许庆友 潘莉 王月华 王香婷 王筝 谷艳丽 张磊磊 丁英钧 赵京山 杜明华【摘要】 目的 目的 观察红花对结扎单侧输尿管诱导的肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用。方法 结扎单侧输尿管方式复制肾间质纤维化实验动物模型，分别给以红花4.0 gkg-1d-1、缬沙坦10 mgkg-1d-1经口灌服，采用免疫组化、原位杂交方法检测大鼠肾脏肾小管上皮细胞表型转化标志物平滑肌肌动蛋白(SMA)及型胶原的表达。结果 单侧输尿管结扎大鼠肾脏SMA动蛋白和型胶原的阳性面积及积分光密度较假手术组明显增强，红花及缬沙坦可显著性抑制其表达。结论 红花可以通过抑制肾小管上皮细胞的表型转化拮抗肾间质纤维化。 【关键词】 单侧输尿管结扎；肾间质纤维化；肾小管上皮细胞表型转化；红花；平滑肌肌动蛋白 【Abstract】 Objective To observe the effect of Safflower on tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation in renal interstitial fibrosis rats induced with unilateral ureteral obstruction (UUO). Methods Renal interstitial fibrosis rats induced with UUO were given orally Safflower(4.0 gkg-1d-1) and Valsartan (10 mgkg-1d-1) respectively. The marker of epithelialmyofibroblast transdifferentiation smooth muscular actin (SMA) and collagen were examined by immunohistochemical method and in situ hybridization. Results The positive area and density ofSMA and collagen in UUO rats increased markedly than those in sham operation group and could be inhibited by Safflower and Valsartan. Conclusions Safflower can antagonize renal interstitial fibrosis by inhibition of epithelialmyofibroblast transdifferentiation. 【Key words】 Unilateral ureteral obstruction(UUO); Renal interstitial fibrosis; Epithelialmyofibroblast transdifferentiation; Safflower; smooth muscular actin ( SMA) 成纤维细胞是肾间质纤维化的主要效应细胞。有证据显示，肾间质的成纤维细胞大部分是通过上皮细胞表型转化而来，有效地抑制肾小管上皮细胞的表型转化对减缓肾间质纤维化的进展有着重要的意义1。采用血管紧张素转换酶抑制剂及血管紧张素受体拮抗剂抑制肾小管上皮细胞表型转化的研究已有大量的报道，采用中药单体或复方抑制体外细胞表型转化的研究也较多2，3，但体内研究开展的较少，对此，本研究采用单侧输尿管结扎（UUO）方式复制肾间质纤维化实验动物模型，观察实验动物体内肾小管上皮细胞表型转化标志物平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达以及由此引起的细胞外基质成分型胶原的变化，给以活血化瘀中药红花治疗，从而证实红花拮抗肾间质纤维化的作用与抑制肾小管上皮细胞表型转化有关。 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 健康8周龄SD大鼠40只，雌性，体重(18010) g，清洁级动物，由河北医科大学动物中心提供。适应性喂养1 w后，随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组及红花组，每组10只。 1.2 药物 缬沙坦纯品由诺华公司提供，红花由三九医药股份有限公司提供，为免煎中药冲剂，每袋中药相当于饮片6 g。 1.3 主要试剂 SMA抗体及原位杂交、SABC试剂盒由武汉博士德生物有限公司提供。型胶原抗体（兔抗大鼠）采用美国Santa Cruz 生物公司产品。 1.4 造模及治疗 假手术组：10%的水合氯醛以30 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉，于左侧中腹部切开皮肤，仅将输尿管游离但不结扎离断。模型组：麻醉如前，于左侧中腹部切开皮肤，游离左侧输尿管，在输尿管上1/3处分别用丝线结扎两道，切断输尿管，逐层缝合皮肤。缬沙坦组：造模同模型组，于造模前1 d起给予缬沙坦10 mgkg-1d-1经口灌服。红花组：方法同缬沙坦组，给予红花4.0 gkg-1d-1经口灌服，模型组及假手术组给以等量生理盐水经口灌服。各组于第14天处死动物，取左侧肾脏以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色进行病理学观察，并采用免疫组化及原位杂交方法检测SMA、型胶原的表达。 1.5 免疫组化方法 SABC法。半定量分析:采用HPIAS1000型全自动彩色病理图象分析系统，在200倍光镜下测量每个显示屏的阳性染色面积和积分光密度，每组选取5只大鼠标本，每个标本测量10个视野进行半定量分析。 1.6 原位杂交方法 按试剂盒说明进行，半定量分析同免疫组织化学。 1.7 统计学处理 使用SPSS11.5软件，数据以xs 表示，组间比较采用单因素方差分析。 2 结 果 2.1 病理学改变 假手术组肾小球、肾小管、间质均无明显异常。模型组见间质大量炎性细胞浸润，肾小管萎缩及扩张，肾小球萎缩，小囊黏连。缬沙坦组可见炎性细胞浸润，肾小管部分萎缩，肾小囊轻度扩张。红花组肾间质有小灶性炎性细胞浸润，肾小管轻度扩张，个别肾小囊扩张。Masson染色:假手术组肾小球、肾小管无异常，间质无纤维增生及炎性细胞。模型组可见间质大量纤维组织增生和炎性细胞浸润，肾小管萎缩与扩张。缬沙坦组肾间质有少量炎性细胞浸润和纤维组织增生，肾小管轻度扩张，肾小囊扩张。红花组肾间质可见炎性细胞浸润和少量纤维组织，肾小管轻度扩张，肾小囊扩张。大鼠肾间质纤维化面积半定量分析结果显示，假手术组纤维化面积平均占总面积的0.4%，模型组肾间质纤维化程度较重，平均占总面积的6.6%（P0.01）；缬沙坦组为1.2%、红花组为1.1%，与模型组比较，肾间质纤维化面积明显减少（均P0.01），提示红花及缬沙坦均有拮抗肾间质纤维化的作用，二者无显著差异。 2.2 SMA蛋白及其mRNA的表达 SMA蛋白表达，假手术组SMA蛋白呈弱阳性表达，主要表达于肾小管上皮细胞及肾小球内，阳性面积和积分光密度分别为（829.65180.75）m2和10.413.10，模型组阳性面积及积分光密度（5 025.522 215.26）m2，72.8435.18较假手术组明显增强（P0.01）。缬沙坦组阳性面积及积分光密度（3 539.081 987.68）m2，50.6229.84）及红花组（3 416.082 013.37）m2，51.0724.89较模型组有显著减少（P0.01）。两治疗组之间无显著差异。SMA mRNA弱阳性表达于肾小管上皮细胞及肾小球内。与假手术组比较，其余各组在肾小管上皮细胞表达显著增强，间质细胞亦有强表达。阳性面积及积分光密度半定量分析显示模型组（5 057.522 233.57）m2，71.4834.49较假手术组（437.88248.37）m2，10.323.10SMA的表达显著升高（P0.01）；缬沙坦组（3 623.921 568.17）m2，51.8313.40及红花组（3 549.121 468.52）m2，50.9714.35较模型组显著下降（P0.05，P0.01），两治疗组之间无显著差异（图1）。 图1 免疫组化检测大鼠肾脏SMA表达（DAB，100）2.3 型胶原蛋白表达 免疫组化方法显示型胶原蛋白在假手术组大鼠肾脏为微量表达，与假手术组比较，其余各组表达显著增强，为条索状或成片块状，主要见于肾小管间质，同时伴有大量的细胞浸润和增生。其中，模型组型胶原的阳性面积及积分光密度值（5 227.252 072.60）m2，72.5529.78较假手术组（448.39236.54）m2，10.242.99显著升高（P0.01）；红花组（3 817.231 824.57）m2，52.5717.94和缬沙坦组（3 608.821 591.82）m2，51.2814.06较模型组显著下降（均P0.05），提示红花和缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中型胶原的表达，二者无显著差异(图2)。 图2 免疫组化检测大鼠肾脏型胶原表达（100） 3 讨 论 近年肾小管上皮细胞在一些因素刺激下转变为成纤维细胞这一表型转化现象已引起关注，处于相对静止的肾小管上皮细胞在低血清、高糖、高蛋白、Ang、TGF1、胰岛素生长因子等的刺激下47，转变成为具有游走功能、大量分泌细胞外基质并表达为SMA阳性的细胞，加重了间质纤维化的形成。此外我们也观察到在某些血管活性肽如肾上腺髓质素缺失状态下，结扎单侧输尿管诱导肾间质纤维化，基因缺失小鼠较野生小鼠肾小管上皮细胞表型转化明显加重8。由于肾脏有大量肾小管细胞的存在，其表型转化对肾脏病的预后就具有重要意义，有效地抑制肾小管上皮细胞的表型转化，可缓解肾脏疾病的进展。 UUO是诱导肾间质纤维化的经典实验模型，且可以避免高血压、高血脂、高血糖等因素的影响，采用这种方式观察肾脏间质纤维化过程中肾小管上皮细胞转分化的改变，结果显示，SMA的阳性面积及积分光密度的表达在蛋白及基因水平上较假手术组均显著性增强，型胶原的表达及纤维化面积与假手术组相比亦有显著性差异。给以血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦及中药红花治疗后，可显著抑制SMA的表达和型胶原的分泌。缬沙坦的主要作用是通过拮抗血管紧张素以及其下游因子TGF1来实现的，而红花的作用尚不完全明白，但我们前期的实验证实与调控肾上腺髓质素的表达有关9。 红花是常用的活血化瘀中药，药性辛温，归心、肝经，主要功效为活血通经，祛瘀止痛，化滞消斑。红花含有多种化学成分，如红花醌甙、新红花甙、红花甙、木脂素类、脂肪油、红花多糖、多种氨基酸等。具有改善心肌缺血、降低冠脉阻力、增加冠脉流量和心肌营养性血流量、降低血脂、抗血小板聚集、提高小鼠的耐氧能力等作用。应用于心脑血管疾病、妇科病等，在肾脏病的治疗中也有很好的临床效果，本研究显示红花可以抑制UUO大鼠肾脏SMA和型胶原的表达，这可能是红花拮抗肾间质纤维化以及治疗慢性肾脏疾病的机制之一，但具体作用成分有待进一步研究。【参考文献】 1 Liu Y.Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis：pathologic significance， molecular mechanism， and therapeutic interventionJ.J Am Soc Nephrol，2004;15(1)：112.2 刘 娜，严海东，徐太静.银杏叶提取物在TGF 1 诱导的人肾小管上皮细胞表型转化中的作用研究J.中国中西医结合肾病杂志，2008;9（3）：2069.3 孙 伟，孙世竹，赖仁胜，等.益肾活血清利复方对HK2细胞TEMT过程中波形蛋白作用的实验研究J.中国中西医结合肾病杂志，2008;9（2）：1524.4 李 玲，邹万忠，张 波，等.病理性因素对体外肾小管上皮细胞表型转化的影响J.中华肾脏病学杂志，2003;19(1):15.5 Okada H，Danoff TM，Kalluri R.Early role of PSP1 in epithelialmesenchymal transformation J.AM J Physiol,1997;273(5):F56374.6 苏 震,郑法雷,李 艳,等.转化生长因子和表皮生长因子在诱