肝细胞癌中缺氧诱导因子1α、热休克蛋白70的表达.doc

肝细胞癌中缺氧诱导因子-1、热休克蛋白70的表达【摘要】 目的 探讨缺氧诱导因子-1(Hypoxiainduciblefactor-1,HIF-1)、热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)在肝细胞癌中的表达及其与癌转移的关系。方法应用免疫组织化学技术检测48例肝细胞癌中HIF-1、HSP70的表达。结果48例肝细胞癌HIF-1阳性率为70.8%,强表达10例,中度表达14例,弱表达10例,无表达14例,与正常对照组比较有显著性差异(P <0.05)。级、级、-级VEGF阳性细胞数三组比较有显著性差异(P <0.05)。患者癌转移者与无癌转移者HIF-1、HSP70比较有显著性差异(P <0.01),HIF-2表达与肝细胞癌恶性程度呈正相关(rr=0.726,P <0.05)。HSP70与HIF-2表达呈正相关( r=0.726,P <0.05)。结论 HIF-2与HSP70表达有相关性,HIF-1、HSP70与癌转移有关, HIF-与HSP70联合检测有助于判断肝细胞癌患者的预后。【关键词】 肝细胞癌 缺氧诱导因子-1 热休克蛋白【Abstract】 Objective: To explore the expression of Hypoxiainduciblefactor-1(HIF-1) and heat shock protein 70(HSP70) in hepatocellular carcinoma, the relation between the expression and metastasis.Method: The expression of HIF-1and HSP70 in 48 patients of liver carcinoma was detected via immunohistochemical analyses.Result:The HIF-1-positive out of 48 patients was 70.8%,including 10 higher expression, 14medium expression, 10 lower expression and 14 non-expression patients,which was siginificantly higher than the controls(P <0.05). VEGF-positive cells among , and grade were obviously different(P <0.05).The expression of HIF-1and HSP70 of the patients with metastasis were siginificantly distinguished from those with no metastasis(P <0.01). and the expression of HIF-2 was positively associated with malignant degree(rr=0.726,P <0.05).The expression of HSP70 and HIF-2 was positively related(rr=0.726,P <0.05).Conclusion: The expression of HIF-2 is correlated with that of HSP70,and HIF-1and HSP70 are associated with the metastasis. The combined detection of HIF-1and HSP70 contribute to judge of the prognosis of hepatocellular carcinoma.【Key words】hepatocellular carcinoma, Hypoxiainduciblefactor-1, heat shock protein 70 HIF-1（Hypoxia inducible factor-1）是1992年发现的一种在缺氧条件下细胞产生的核蛋白,它与靶基因结合,促进其转录,使机体产生一系列缺氧适应反应1。现己证实，在任何氧浓度降低的情况下，如全身缺氧、脑动脉阻塞，都可能诱导HIF-1的快速大量表达2。肝细胞癌发生后，肿瘤的不断生长、体积增大,血供不足发生缺氧坏死,可诱导HIF-1过度表达。因此，对以上过程在肝脏中对于下游基因的表达及与癌转移的关系成为近期的研究热点。我们应用免疫组织化学技术对48例肝细胞癌及9例正常肝组织中的HIF-1、HSP70的表达进行研究，探讨与癌细胞转移、临床预后的关系。 1 资料与研究方法 1.1 一般资料48例肝细胞癌组织取自华中科技大学同济医学院附属同济医院2006.02-2007.05手术切除标本。男28例,女20例。年龄36-71(平均56.0)岁。其中经病理学检查证实伴转移者28例,无转移者20例。按Furhman分级:级18例,级19例,级7例,级4例。9例癌旁正常肝组织(远离肿瘤边缘>5cm)作为对照,并经病理切片证实。 1.2 免疫组织化学方法测定脑细胞的HIF-1表达 1.2.1 主要试剂鼠抗人HIF-1(Lot:MS -1164-P0)购自美国NOVUS公司。SP检测试剂盒、DAB检测试剂盒均购自Sigma公司。VEGF检测试剂盒(LOT:D -182)、0.1%EDTA抗原修复液(PH=9.0)、100%山羊血清购自北京中山生物试剂公司。 1.2.2 主要染色步骤常规PBS(PH=0.1)代替一抗作为阴性对照。HIF-1染色步骤:石蜡切片60烤箱烤片15min,梯度乙醇脱蜡至水,3%H2O2室温孵育15min,0.1%EDTA150ml微波抗原修复45min,凉至室温,10%血清封闭15min,加入1200一抗4过夜,生物素化二抗室温孵育35min,加链亲素酶标室温孵育30min,DAB显色10min,脱水,透明,中性树胶封固。HSP70染色步骤:石蜡切片60烤箱烤片15min,梯度乙醇脱蜡至水,10mmol 0.1%EDTA(PH=9.0)微波抗原修复20min,室温45min,3%H2O2室温10min,10%血清封闭15min,加入试剂一抗4过夜,生物素化二抗37孵育40min,加链亲素酶标室温孵育30min,DAB显色8min,脱水,透明,中性树胶封固。 1.3 结果判定HIF-1:细胞核有浅黄色、棕色、棕褐色颗粒为阳性细胞,观察5个高倍镜视野(1020倍)阳性细胞所占比例,无阳性细胞或阳性细胞数<1%为阴性,阳性细胞数1%-10%为阳性(+),11%-50%为中度阳性(+),>50%为强阳性(+)。HSP70:胞质有浅黄色、棕色、棕褐色颗粒为阳性细胞,观察5个高倍镜视野(1020倍)计算面积中阳性。细胞数的平均值,将其分为3级:<50%为级,50%-80%为级,80%为级。 1.4 统计学处理应用SPSS12.0系统统计分析软件包进行数据处理。数值变量资料的比较采用单因素方差分析(ANOV),两两比较采用q检验,分类数据变量资料的比较采用行列卡方检验,相关分析采用Spearman及Pearson等级相关分析。等级分布趋势采用Radit分析。 2结果 2.1 HIF-1的表达 HIF-1主要表达于癌细胞胞核,胞浆也有表达,正常肝组织无HIF-1表达。其阳性细胞主要出现于肿瘤边缘或与正常组织交界处,在坏死的肿瘤组织中也出现阳性细胞。分化程度高的肝细胞癌胞核有棕黄色细颗粒,染色淡,阳性细胞少;分化程度低的肝细胞癌胞核棕黄色着色较深,阳性细胞多。本研究中48例肝细胞癌组织中HIF-1总阳性表达率为70.8%,其中强表达10例,中度表达14例,弱表达10例,不表达14例。HIF-1表达在不同分化程度组织间有显著性差异(212.58,P <0.05)。HIF-1表达水平与肿瘤分化程度呈正相关(r=0.682,P <0.01)。 2.2 HSP70的表达不同分化程度的肝细胞癌胞质均有HSP70表达,分化程度高的肝细胞癌细胞VEGF表达着色淡,分化程度低的肝细胞癌细胞着色深,并在肿瘤组织边缘表达强烈,在肿瘤坏死区也有表达。本研究中肝细胞癌级、级、级VEGF阳性细胞数分别为(5224)、(10634)、(16648)个,3组比较有显著性差异(2=14.38,P <0.05)。 2.3HIF-1、HSP70与癌转移癌转移者HIF-1、VEGF均呈较高等级分布,而无癌转移者HIF-1、VEGF则均呈较低等级分布,两者有显著性差异(P <0.05)。 2.4HIF-1与HSP70的关系结果表明, HSP70与HIF-1表达水平呈正相关(r=0.726,P <0.05)。 3 讨论 HIF-1是一种适应缺氧诱导的核转录因子，所有哺乳动物细胞缺氧时均表达HIF-13。有实验表明，在常氧状态下的Hep3B细胞核及细胞浆中未检测到HIF-1，而当细胞用1%正常氧浓度处理0.5-6h后1在胞核中明显增加4。 肿瘤形成过程中一个关键的步骤是肿瘤细胞对缺氧的适应,而适应缺氧的策略则是形成多血管体系和提高糖酵解速率。通常,HIF调控的基因涉及能量代谢、激素代谢、肿瘤血管生成和转移等多个方面,具体介导转录的基因有热休克蛋白（HSP）、血管内皮因子(VEGF)、葡萄糖载体1(glucosetransporter,GLUT1)、转铁蛋白、血红素氧化酶-1等。Kevin等3发现在肝细胞癌,HIF主要是增强下游靶基因VEGF、GLUT1和糖酵解酶等基因表达,从而影响肿瘤血管生成和细胞能量代谢。因此,HIF-1信号传导通路可能在肝细胞癌生成中具有重要作用。 本研究免疫组织化学结果表明,48例阳性率为70.8%,9例癌旁正常肝组织中组织HIF-1均阴性表达,与Kevin等3研究结果一致。肝细胞癌细胞核和细胞质都可表达HIF-1,但主要在胞核表达。HIF-1表达水平与肝细胞癌分级、肿瘤恶性程度呈正相关,肿瘤的分级、恶性程度越高核染色越深,阳性表达率越高,并发现在肿瘤边缘浸润脑组织的肝细胞癌细胞内HIF-1表达上调,提示HIF-1与恶性肿瘤的浸润性和分化程度有关。 HSP70是一种对缺血性损伤敏感的应激蛋白5。本实验结果表明,癌组织中肝细胞癌恶性程度越高, HSP70表达越强烈。这可能与坏死组织缺氧程度较高有关;同时,我们还观察到癌转移者HIF-1、HSP70均呈较高等级分布,而无癌转移者则均呈较低等级分布,两者有显著性差异(P <0.05),表明肝细胞癌HIF-1、HSP70表达与肿瘤转移有关,HIF-1、HSP70高表达较多者,肿瘤转移或潜在转移的可能性较大。 目前，有关HIF-1与HSP70关系的研究主要在基础研究方面。本实验结果表明,HIF-1与HSP70表达存在一定的正相关关系,其机制可能为随着肿瘤的不断生长、体积增大,血供不足发生缺氧坏死,诱导HIF-1过度表达, 肝细胞进而在以上各种应激状态下发生热休克反应合成了HSP70。HSP70作为一种主要的应激蛋白，对细胞缺血性损伤的修复、毛细胞血管的生成及蛋白的合成起着重要作用。用HSP70单克隆抗体定位来确定缺血后HSP70表达的作用,发现在短暂缺血后死亡的肝细胞中HSP70蓄积甚少,而存活的肝细胞中有明显的HSP70积累6,表明HSP70的蓄积具有组织保护作用,是肝细胞存活的原因之一。其保护机制可能与与钙离子,自由基及兴奋性氨基酸有关7。 综上所述,肝细胞癌发生后,由于血供不足诱导HIF-1过度表达, 应激状态下产生的HSP70通过减轻缺血性损伤，增加毛细血管的生成及减轻细胞凋亡等途径使肿瘤细胞的增殖、移行加快，促进恶性肿瘤的生长、浸润和转移，使肿瘤细胞在适应缺氧、能量代谢、细胞凋亡及转移中起重要作用。因此,联合检测HIF-1、HSP70可作为判断肝细胞癌患者转移潜能和预后的重要指标。参 考 文 献 1 王海平,陈孝平,丁磊等. 乙肝病毒x 蛋白激活缺氧诱导因子1通路促进血管内皮生长因子表达的研究.中华肿瘤杂志,2003 ,25 :433-436.2 Sanchez ET ,Botella LM ,Velasco B ,et al. Synergistic cooperation between hypoxia and transforming growth factor2beta pathways on humanvascular endothelial growth factor gene expression. J Biol Chem ,2001,19,276:38527238535.3 Blancher C,Moore JW,Talks kl,et al.Relationship of hyposia-inducible factor HIF-1alpha expression to vascular endothelial growth f