茶多酚诱导膀胱癌T24细胞凋亡及上调PTEN表达.doc

茶多酚诱导膀胱癌T24细胞凋亡及上调PTEN表达 作者：应荣彪，瞿海江，姚俊，胡哲，黄海涛【摘要】 目的 探讨茶多酚(TP)抑制膀胱癌细胞生长的可能分子机制。方法 采用MTT法和流式细胞术，观察膀胱癌细胞系T24经不同浓度TP处理后细胞生长及PTEN蛋白表达的改变。结果 TP以剂量依赖的方式抑制膀胱癌细胞的生长，加入0、50、100、200、400 g/mL TP的T24细胞抑制率分别为0%、11.2%、33.4%、36.9%、67.5%。流式细胞仪直方图上可见亚二倍体峰，癌细胞出现凋亡，凋亡率分别为6.8%、25.1%、28.6%、36.6%、41.1%；同时，随TP作用浓度的增加，G1/S阻滞细胞逐渐增多，细胞分裂增殖指数(PI)降低；而细胞PTEN蛋白表达水平由(37.660.49)逐渐增加至(163.923.36)(P<0.01)。结论 TP对T24细胞生长具有抑制作用，其机制可能是通过上调PTEN 蛋白表达影响细胞周期和诱导细胞凋亡。 【关键词】 茶多酚；膀胱癌；凋亡；PTEN蛋白 茶多酚(TP)是茶叶中最具有抗肿瘤活性的酚类化合物。研究发现，茶及TP能抑制膀胱癌发生和发展1-2。本实验用TP作用于体外培养的膀胱癌T24细胞株，观察TP对膀胱癌T24细胞株生长及其PTEN蛋白表达水平的影响，探讨TP抑制肿瘤细胞株生长的可能分子机制。 1 材料与方法 1.1 材料 T24细胞株，购自中国科学院上海细胞生化研究所；TP购自中国茶叶研究所；鼠抗人PTEN为美国MBI公司产品，RPMI1640培养液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、0.25%胰蛋白酶为美国Sigma公司产品，羊抗鼠IgG为美国Zymed公司产品，10%小牛血清购自杭州四季青生物公司，硫氰酸荧光素(FITC)为北京金山生物有限公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品。 1.2 方法 1.2.1 膀胱癌细胞株T24的培养 膀胱泌尿上皮癌细胞T24株于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液(内含青霉素、链霉素10万U/L)中37 、5%CO2培养至细胞对数生长期，进行实验。 1.2.2 MTT法观察 用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，分别将2种对数生长期的膀胱癌细胞调配成5104/mL的单细胞悬液，接种于96孔板(0.2 mL/孔)。设空白阴性对照组及不同浓度(50、100、200、400 g/mL)的TP组，各设5个平行孔，培养48 h，实验终止前4 h加入MTT液(5 mg/mL)10 L/孔，反应完毕弃上清液加入DMSO 100 L/孔溶解沉淀，轻轻振动后用波长570 nm的酶联仪测定各孔的A值，求出生长抑制率IR=(1-用药组平均A值/对照组平均A值)100%。上述所有实验均重复3次。 1.2.3 流式细胞仪测定(FCM) 取对数生长期的膀胱癌细胞，取1106/mL细胞接种到96孔培养板(0.2 mL/孔)，每组3孔。加入不同浓度的TP，并各设2个平行组为TP组；加入等体积生理盐水的RPMI 1640细胞培养液为对照组。培养48 h后，以0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，TP组和对照组分别进行下列检测。细胞周期的检测：PBS洗涤2次，加入10 mg/L RnaseA 200 L，水浴30 min，碘化丙啶染色30 min，4 避光。FCM检测细胞周期，并计算细胞分裂增殖指数(PI)=(S+G2M)/(G1+S+G2M)100%。癌细胞PTEN表达强度的检测：平行组和对照组分别加入鼠抗人PTEN 20 L，PBS洗涤5 min，共洗3次；分别加入140稀释的羊抗鼠IgG-FITC抗体20 L，37 孵育30 min，PBS冲洗5 min，共洗3次；4 孵育30 min后，FCM检测膀胱癌细胞PTEN的表达，以荧光强度的几何均数表示。细胞凋亡率(APO)检测：平行组和对照组分别用Celleguest软件分析，根据细胞fl2荧光分布直方图(fl2为接收波564-606)获取阳性标记细胞的凋亡率。上述所有实验均重复3次。 1.2.4 统计学处理 数据以均数标准差(xs)表示，运用SPSS10.0 软件进行分析，组间比较采用t检验。 2 结 果 2.1 TP抑制膀胱癌细胞生长及对细胞增殖周期的影响 TP处理48 h后，T24细胞随着TP浓度从0 g/mL升到400 g/mL，其生长抑制率从0增加至11.2%、33.4%、36.9%、67.5%，TP的浓度与其生长抑制率呈现明显的正相量效关系。FCM分析发现：G1期细胞所占细胞周期的百分比随着TP浓度的增加而增加，S期和G2M期细胞逐渐减少；同时随着TP浓度的增加，PI值逐渐减小，提示细胞分裂增殖活动逐渐减弱，细胞各周期中的变化也显示一定的量效关系(表1)。 2.2 TP诱导T24细胞凋亡 碘化丙啶染色FCM检测可见在正常G1期峰前出现不同于细胞碎片图形的亚二倍体峰(凋亡峰)，目前认为此峰的出现是确定细胞发生凋亡的标志之一。随着TP浓度的增加，T24细胞的凋亡率亦逐渐增加，由空白对照组的6.8%逐渐增加至TP作用浓度为400 g/mL时的41.2%，提示TP诱导T24细胞凋亡率有一定的量效关系。 2.3 TP上调PTEN蛋白的表达 随着TP作用浓度的升高，T24细胞PTEN蛋白的表达水平逐渐增强，并与TP抑制细胞的生长(IR值)及诱导癌细胞凋亡率相平行。在TP>50g/mL的各个浓度点，各细胞株与其对照组的PTEN蛋白表达有显著性差异(P<0.05或P<0.01，表1)。表1 膀胱癌T24细胞经TP处理前后细胞各浓度点的分布和PTEN表达 3 讨 论 TP是非细胞毒类药物，通过对基因调控或抑制DNA复制相关酶活性及核苷转运影响DNA合成，干预细胞增殖有关的信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡或直接抑制肿瘤细胞生长、杀死肿瘤细胞1-5。本研究结果提示，在剂量较大时，TP以剂量依赖方式抑制膀胱肿瘤T24细胞株的生长增殖，诱导其凋亡，并使T24细胞阻滞于G1/S限制点。但其诱发凋亡的机理目前尚未明了，可能与其调控某些癌基因/抑癌基因的表达有关，包括bcl-2、c-fos、c-myc、p53、survivin6。 PTEN是一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，活化的PTEN能调控3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)活性，阻断蛋白激酶B(PKB/Akt)，使细胞阻滞于G1期并使其对凋亡敏感，并具有抗肿瘤细胞浸润、转移的作用7-9。Liang等3-4通过对乳腺癌细胞的研究，认为茶多酚的重要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和黄酮类化合物(flavopiridol)可通过调控肿瘤细胞G1期的p21、p27、细胞周期素(cycles)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活性，抑制乳腺癌细胞生长。Tanaka等9将野生型PTEN通过腺病毒载体导入UMUC23和T24膀胱癌细胞系，使PTEN过表达，抑制了PKB/Akt的磷酸化活性，出现细胞周期G1期的停滞，生长抑制，形态发生明显的变化，对化疗药物的敏感性增强。本研究结果提示，TP 400 g/mL作用于T24细胞，其抑制率为67.5%、APO为41.1%，且以正相剂量依赖关系上调T24细胞的PTEN蛋白表达。抑制率和凋亡率的上升与细胞表达PTEN水平增高相一致。表明，细胞PTEN蛋白的表达变化是肿瘤细胞发生凋亡和生长抑制的可能原因。推测TP可能通过PTEN表达的上调，调控PKB/Akt信号通路，进而调节细胞周期蛋白(cyclin)E/D、CDKs、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKIs)等的活性，抑制T24细胞的生长增殖，并诱导细胞凋亡7-10。两方面的协同作用可能是TP杀灭膀胱癌细胞的作用机制之一。 TP的这种细胞毒作用选择性不高，不仅对肿瘤细胞有明显的杀伤作用，对正常组织细胞也有杀伤作用。如何减少TP对正常组织细胞的损伤并进一步阐明TP影响PTEN表达量及其相互作用机制等问题，尚需进一步研究。【参考文献】 1Lin SS, Hung CF, Tyan YS, et al. Ellagic correction of ellagica acid inhibits arylamine N-acetyltransferase activity and DNA adduct formation in human bladder tumor cell lines (T24 and TSGH 8301) J. Urol Res, 2001, 29 (6):371-376.2Kemberling JK, Hampton JA, Keck RW, et al. Inhibition of bladder tumors growth by the green tea derivative epigallocatechin-3-Gallate J. J Urol, 2003, 170(3):773-776.3Liang YC, Lin Shiau YC, Chen CF, et al. Inhibition of cyclin dependent kinases2 and 4 activities as well as Induction of Cdk inhibitors p21 and p27 during growth arrest of human breast carcinoma cell by (-)-epigallacatechin-3-gallate J. J Cell Biochem, 1999, 75(1):1-12.4Carlson BA, Dubay MM, Sausville EA, et al. Flavopiridol induces G1 arrest with inhibition of cyclin-dependent kinase (CDK2 and CKD4) in human breast carcinoma cells J. Cancer Res, 1996, 56(13):2973-2978.5王田，邱学德，黄杰，等. 茶多酚对膀胱肿瘤端粒酶活性的影响 J. 现代泌尿外科杂志, 2005, 10(6):314-316.6Ju J, Hong J, Zhou JN, et al. Inhibition of intestinal tumorigenesis in Apcmin/+ mice by (-)-epigallocatechin-3-gallate, the major catechin in green tea J. Cancer Res, 2005, 65(22):10623-10631.7Wu X, Obata T, Khan Q, et al. The phosphatidylinositol-3 kinase pathway regulates bladder cancer cell invasion J. BJU Int, 2004, 93(1):143-150.8汪清，辛殿祺，丁义，等. 茶多酚诱导EJ膀胱肿瘤细胞凋亡并增加化疗药物吡柔比星的抗肿瘤协同作用 J. 中华实验外科杂志, 2005, 22(1):12-14.9Tanaka M, Koul D, Davies MA, et al. MMAC1/ PTEN inhibits cell growth and induce