贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达.doc

贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达【摘要】 目的： 实现贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease, Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达，验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-like protease基因家族成员。方法： (1)提取贵阳腐霉总RNA，以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术扩增Pr1基因ORF片段；(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP，转化表达菌株E.coli ER2566，IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶。结果： 成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP，实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达。结论： 证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区。 【关键词】 灭蚊； 枯草杆菌蛋白酶类； 逆转录聚合酶链反应； 基因，真菌； 贵阳腐霉； 类枯草菌素蛋白酶； 原核表达 Abstract Objective: To verify if a DNA fragment we obtained from Pythium guiyangense Su before is the ORF of a subtilisin-like protease (Pr1) of P. guiyangense, a fungal pathogen of mosquitoes. Methods: A prokaryotic expression system was established: The total RNA of P. guiyangense was extracted at the time point of most abundant expression of Pr1, and cDNA was obtained with reverse transcription PCR. The subject sequence was cloned. A plasmid pTWIN1-Pr1-EGFP containing the sequence as well as an EGFP gene was constructed, and transformed into ER2566 cells. The gene expression was observed after IPTG induction. Results: Green fluorescence protein expressed and Pr1 activity increased in ER2566 cells after the transformation. Conclusions: Its proved that the DNA fragment is really ORF of a Pr1 gene of P. guiyangense, and that the method for verification of cloned gene is efficient. Key words mosguito control; subtilisins; reverse transcriptase polymerase chain reaction; genes,fungal; Pythium guiyangense Su; subtilisin-like protease; prokaryotic expression 贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)是由贵阳医学院苏晓庆教授分离得到的一株具有自主知识产权的可以高效地、特异地杀灭蚊幼虫的水生丝状真菌，可以有效切断经蚊虫传播疾病的途径1。通过研究发现，与其它昆虫病原真菌一样，P. guiyangense菌株在侵染孑孓体壁过程中也会分泌蛋白酶（Pr1、Pr2蛋白酶）、几丁质酶和脂酶等水解酶。尤其是Pr1蛋白酶能降解昆虫体壁，在贵阳腐霉侵入孑孓体内过程中应该起重要作用，是贵阳腐霉等昆虫病原菌重要的毒力因子2。为了采用基因工程培育贵阳腐霉优良菌株，对该菌的胞外蛋白酶进行研究，并于2004年克隆了一长1 519 bp 的疑是Pr1蛋白酶的DNA片段(YP1977)，为了进行验证，构建了Pr1-EGFP融合基因，再将该融合基因转化大肠杆菌，对其中Pr1蛋白酶的表达进行观察。 1 材料与方法 1.1 菌株与质粒 贵阳腐霉由贵阳医学院生物防治课题组保存。E.coli ER2566、 pTWIN1购自NEB公司。 1.2 YP1977片段的引物合成 根据软件预测分析已获得的基因片段YP1977，确定其含有一个可能的ORF阅读框，以此阅读框为模板，使用软件Primer Premier5.0设计引物SL1(5-CCGCTCGAGGACCCATTCCGAAAGTCCAAGA-3)和SL2（5-CGGGATCCTACAACCGTCCTCCTAACAC-3），在上游引物SL1的5端加上了保护碱基CCG和Xho酶切位点序列，在下游引物SL2的5端加上了保护碱基CG和BamH的酶切位点序列。由上海生工生物技术有限公司合成。 1.3 总RNA的提取 参照 Chomczynski 3等方法修改后提取RNA，分别提取诱导了24 h、36 h、48 h、60 h的贵阳腐霉菌丝体RNA，等量混合备用。 1.4 RT-PCR扩增Pr1基因ORF片段 根据Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作合成cDNA 第一链，以贵阳腐霉基因组cDNA为模板，使用上述引物SL1和SL2进行PCR扩增。反应程序为：95 变性，5 min；35轮循环（94 ，45 s；59 ，1 min；72 ，1 min)；72 延伸，10 min；4 保存。 1.5 绿色荧光蛋白基因（EGFP）ORF序列的克隆 以质粒pEGFP-C1 为模板，根据GenBank 中已知的绿色荧光蛋白（EGFP） 编码基因的序列，设计一对引物P1（5-AGCATATGGTGAGCAAGGGCGAG -3）和P2（5-CCGCTCGAGTGACTTGTACAGCTCGTC -3），在上游引物P1的5端加上了保护碱基AG和Nde酶切位点序列，在下游引物P2的5端加上了保护碱基CCG和Xho的酶切位点序列。PCR扩增，1.0琼脂糖凝胶电泳检测，回收试剂盒、目的条带。该片段以Xho和Nde双酶切后连接到质粒pTWIN1上。 1.6 重组表达质粒pTWIN1-Pr1-EGFP的构建 PCR产物纯化试剂盒回收RT-PCR产物OPr1片段，BamH和Xho双酶切回收后的片段，与经过相同酶切的大肠杆菌绿色荧光表达载体pTWIN1-EGFP连接，构建表达质粒pTWIN1-Pr1-EGFP。见图1。 1.7 转化大肠杆菌 采用常规技术活化E.coli ER2566，制备其感受态细胞，并将重组质粒转入该感受态细胞4，5。 1.8 Pr1基因在大肠杆菌中表达后的活性检测 参照Kim6等人的方法，挑取重组表达质粒阳性克隆接种于含有100 mg/L Amp 的LB液体培养基中，37 振荡培养过夜，1.0接种量转接于等体积含有100 mg/L Amp 的LB液体培养基中，37 振荡培养至OD600达到0.50.7。加入IPTG（终浓度为1 mol/L）诱导Pr1基因的表达，30 振荡培养14 h。收集菌体，超声波破碎细胞（80 W、工作8 s，15个循环），取上清液，用专一性底物Suc-(Ala)2-Pro-Phe-PNA检测Pr1蛋白酶活性，并进行SDS-PAGE检测蛋白产物。 所有实验皆以未转化的E.coli ER2566 作对照，其中对Pr1蛋白酶活性检测的OD值进行t检验。 2 结果 2.1 贵阳腐霉总RNA的提取 根据贵阳腐霉产Pr1蛋白酶曲线，收获诱导培养了24 h、36 h、48 h和60 h的贵阳腐霉菌丝体，提取其RNA，等量混合70 备用。本实验提取的RNA用紫外分光光度计测得：OD260/OD280=1.91，符合RNA纯度的要求， RNA电泳结果如图2所示。28 SrRNA/18 SrRNA 比例约为2/1，带清晰，满足RNA完整性的要求。因此，该总RNA符合反转录合成cDNA的要求。 2.2 RT-PCR扩增 Pr1基因ORF片段 利用引物SL1和SL2，以Pr1基因的cDNA链为模板， PCR产物OPr1大小约1 000 bp（图3），符合预期要求。 2.3 RT-PCR扩增产物OPr1测序结果BLAST比对等序列分析结果显示，本次RT-PCR扩增产物OPr1的核苷酸序列和已知序列YP1977中预测的ORF序列是一致的，含有334个氨基酸，并有起始密码子和终止密码子，是一个完整的蛋白读码框。更重要的是含有组氨酸残基（His）和丝氨酸残基（Ser）2个活性位点，这2个活性位点是分解昆虫表皮蛋白的重要活性中心。 2.4 重组表达质粒pTWIN1-Pr1-EGFP的筛选、鉴定 经过蓝白斑初筛选后，挑取白斑单菌落，过夜活化后，提取质粒pTWIN1-Pr1-EGFP。以此质粒为模板，SL1和SL2为引物，PCR扩增含有Pr1基因ORF序列的DNA片段，电泳检测PCR产物，PCR产物大小约1 000 bp（图4）。2.5 融合基因Pr1-EGFP在大肠杆菌中的活性表达 （1）诱导表达的菌株在离心管中，经长波紫外线（300 nm）照射后，肉眼可见明亮的绿色荧光，见图5所示；（2）挑选重组质粒pTWIN-Pr1-EGFP转化E.coli ER2566的8个阳性转化菌落，参照St.Leger等7的方法，利用特异性短肽底物在其中检测出远高于未转化菌株的Pr1蛋白酶活性（表1）；（3）SDS-PAGE电泳图谱上约60 kDa处出现清晰的诱导表达条带，其中，EGFP融合蛋白分子量约27 kDa，Pr1分子量约33 kDa，与预期的相符，如图6所示。 表1 表达菌株E.coil ER2566 中Pr1蛋白酶活性(OD410 nmmin-1ml-1)3 讨论 Pr l蛋白酶属于枯草杆菌类蛋白酶家族(subtilisin family)，广泛存在于昆虫病原真菌中。它由病原真菌在昆虫表皮形成的附着胞分泌，能降解昆虫体壁，是帮助病原真菌入侵昆虫宿主的重要蛋白酶之一。St.Leger7等发现，Pr1蛋白酶是昆虫致病的决定因素，并通过金龟子绿僵菌转化该菌导致Pr1a基因的高效表达，使转化后的金龟子绿僵菌毒力明显提高，杀虫时间缩短了25，作物损失减少了40。同时，他们还证明了在昆虫血淋巴中高浓度的Pr1a蛋白酶会引起昆虫酚氧化酶的过度表达，成为导致昆虫死亡的第2个原因8。因此，Pr1蛋白酶基因被用作昆虫病原真菌基因工程改良的突破口。该酶及其基因成为国内外研究的焦点911。 本实验选择技术较成熟的大肠杆菌表达系统从3个方面验证了它就是贵阳腐霉的一个Pr1蛋白酶基因的编码区12。（1）使用NEB公司的pTWIN1表达系统，并且选用EGFP作为标记基因，融合在Pr1基因的N端，构建成Pr1-EGFP融合基因。诱导表达后的菌株，不经紫外线照射，肉眼即可看到离心沉淀后的菌株呈现淡淡的绿色，在紫外线（300 nm）照射下，可看到明亮绿色荧光，标志着Pr1-EGFP融合基因的成功表达。（2）对转化的大肠杆菌中的Pr1蛋白酶活性进行了检测。分别挑取8个阳性单菌落，诱导表达后，超声波破碎，取上清液利用专一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA测定Pr1蛋白酶活性。经统计学分析证明，转化菌株的1蛋白酶活性远高于未转化的对照菌株。（3）采用SDS-PAGE电泳，进一步确认Pr1蛋白酶的表达。已知EGFP融合蛋白分子量约27 kD，Pr1分子量约33 kD，二者分子量总和应为60 kD。从电泳图看出，表达菌株诱导1.5 h后在60 kD附近就有Pr1-EGFP融合蛋白分子带。当诱导4 h后，该蛋白的表达量进一步增多。电泳结果与预期的相符。 上述结果说明OPr1在大肠杆菌中成功表达Pr1蛋白酶，证明所获取的片段OPr1是Pr1蛋白酶基因的编码区，这就为采用该基因转化贵阳腐霉，使其超表达提高该菌毒力打下基础。【参考文献】 1 Su Xiaoqing .A new species of Pythium isolated from mosquito larvae and its ITS region of rDNA J. Mycosysteama，2006（4）：523-528.2 St Leger R J.The role of cuticle-degrading proteases in fungal pathogenesis of insectsJ. Can J Bot，1995(73):1119-1125.3 Chomczynski P，Sacchi N. Single-step method of RNA isolation baacid guamdinum thiocyanate-phenol-chlortormJ .Anal Riochem,1987(162):156-159.4 卢圣栋.现代分子生物学实验技术 M. 北京：中国协和医科大学出版社，2001：69.5 萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南M. 北京：科学出版社，2003：96-99.6Hyun-Kyu Kim, Hyang-Sook Hoe.Gene structure and expression of the gene from Beauveria bassiana encoding bassiasin, an insect cuticle-degrading serine proteaseJ.Biotechnology Letteers，1999(21):777-783.7 St Leger R J, Bidochka M J,Roberts D W.Isoforms of the cuticle-degrading