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基因操作技术的基本条件,C 用于基因转移的受体菌或细胞,B 用于基因克隆的载体,A 用于核酸操作的工具酶,看书找答案,1、核酸酶分哪两种，有什么差别？ 2、限制性核酸内切酶分几种，哪种最常用，为什么？ 3、DNA连接酶的作用是什么，哪两种较常用？ 4、大肠杆菌DNA聚合酶的种类和作用,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割,A 用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,一、限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出,Hind II和Hind III,一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5磷酸二酯键。,核酸酶分为： 外切核酸酶【从一头开始，顺序切断】 内切核酸酶【能识别特定序列切断】 内切酶生理意义：分解外来DNA，保护自身DNA,二、限制性核酸内切酶的类型及其主要特性,特性 1. 限制修饰活性 2. 内切酶的蛋白 质结构 3. 限制辅助因子 4. 切割位点 5. 特异性切割 6. 基因克隆中,I 型 双功能的酶 3种不同亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 距特异性位点5端至少1000bp 不是（随机） 无用,II 型 限制酶和修饰酶分开 单一成分 Mg2+ 位于识别位点上 是 非常有用,III 型 双功能酶 2种亚基 ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸 特异性位点3端24-26bp处 是 用处不大,限制性核酸内切酶,三、限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,分离顺序： 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,四、影响限制性核酸内切酶活性的因素,1、DNA样品的纯度：,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,2、DNA样品的甲基化程度：,3、核酸内切酶的缓冲液性质,与II型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端 cohesive ends：指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平 末 端 Blunt end：在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。,带5P端的黏性末端,带3OH 和5P端的平末端,（一）DNA连接酶的发现,首个DNA连接酶(ligase)1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码的 。 1970年，发现了T4 DNA连接酶 ， 由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。,二、 DNA连接酶,（二）常用的DNA连接酶,E.coli DNA连接酶 ：连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。 T4DNA连接酶：连接具互补碱基黏性末端和平末端， 需ATP辅助因子，活性高，常用。,（三）T4 DNA连接酶连接反应的条件,影响连接效率的因素有： A. 温度（通常在4-15 ） B. ATP的浓度(10ML - 1) C. 连接酶浓度（平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多，一般平末端大约需12U，黏性末端仅需 0.1U） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1151）,三、DNA聚合酶,催化合成DNA的酶 特点：不能自行从头合成DNA链，必须有一个RNA引物 分类: 大肠杆菌DNA聚合酶 T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶,（一） E.coli DNA聚合酶 1. E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复：具35和53外切酶活性 pol II 参与DNA修复：具35外切酶活性 pol III 参与DNA复制：具35和53外切酶活性,2. E.coli pol 的特点,1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性 在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其大片段称为Klenow片段, 具35外切酶活性 2） 聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA 3） 外切酶活性,（二）T4 DNA聚合酶 1. 特点： 53聚合酶活性；35外切酶活性【对单链DNA强】 2. 用途： 制备高比活性探针,（三） Taq DNA聚合酶 1. 特点： 分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75， 对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性,2. 用途,主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4106倍,四、其它DNA修饰酶,磷酸酶和T4多聚核苷酸激酶 DNA酶（ DNase I） RNA酶（ RNase） 末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）,一、DNase I 1. 特点：具内切酶活性，但无核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值 2. 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口,ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口,RNase,RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。,核酸修饰酶,末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）,TdT的基本特性：来自小牛胸腺,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,外源基因不易自己进入细胞 进入后不能自我复制 二、什么是载体（vector ）？ 携带外源目的基因； 进入宿主细胞； 进行扩增和表达的具有运载能力的DNA 三、分类 克隆载体【扩增】；表达载体【表达外源基因】,一、为什么要用载体？,B 用于基因克隆的载体,四、作为载体的DNA分子必须具备条件：,1.有复制子，至少有一个复制原点，能自主复制或整合到染色体DNA上随其复制而同步复制。 2.有1至多个克隆位点，供外源DNA片段插入载体DNA分子。,克隆位点【外源DNA进来的座位】 克隆位点就是限制酶的识别位点 【方便剪开载体，和外源DNA粘到一起】,A、一个载体，一种限制酶识别位点只有一个 B、位点都在非必需区，剪开也不影响载体本身的复制。,3.必须具有用于选择克隆子的标记基因 （1）抗性标记基因：抗生素抗性、重金属抗性(Cur ，Znr )、代谢抗性(TK，抗除草剂基因) （2）营养标记基因:主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因 （3）生化标记基因(其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ),常用的遗传标记基因 1) 氨苄青霉素抗性基因（Ampr） 2)四环素抗性基因（Tetr）,Ampr抗性基因编码一种-内酰胺酶，可特异地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力,五、载体的种类,根据来源可分为： 质粒载体 噬菌体载体 大分子DNA克隆载体 病毒载体,（一）质粒载体,大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成，是应用最广的载体。,质粒,质粒的基本特征,质粒是能独立于寄主染色体而自主复制、 并被稳定遗传的一类核酸分子,质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型,严紧型复制控制的质粒,松弛型复制控制的质粒,质粒,质粒的构建,理由：天然存在的野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数野生型质粒构建的,pSC101 四环素抗性标记基因 Tetr,ColE1 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,常用的质粒载体,是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19,理想质粒载体应具备特点：,1. 松驰型复制子 复制子（replicon）是质粒自我增殖所必需 2. 几个单一的酶切位点（或多克隆位点） 以便目的DNA片段插入,一、质粒载体,一、质粒载体,3. 插入失活的筛选标记 一般应具有两种抗菌素抗性标志 如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等 4.分子量相对较小和较高的拷贝数 5.缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的DNA,一、质粒载体(plasmid vector),（一） pBR322质粒载体,（二） pUC质粒载体系列,（一） pBR322质粒载体,pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一，至今尚在使用。 pBR322载体的组成： 复制起始位点（ori） Ampr Tetr,一、质粒载体,p代表质粒; “BR”代表两位研究者 Bolivar和Rogigerus 姓氏的字首； “322”是实验编号,pBR322质粒载体和特点,1. 带有一个复制起始点（ori） 2. 抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记 3. 数个单一的限制性酶切位点 当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活,一、质粒载体,4. 较小的分子量 易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大 小的外源DNA片段。 5. 较高的拷贝数 经氯霉素扩增后，每个细胞达10003000个拷贝。,一、质粒载体,r,r,pBR332质粒结构示意图,（二） pUC质粒载体系列,在pBR322基础上改建而成,一、质粒载体,典型的pUC质粒载体有4个组成部分： 来自pBR322 质粒的复制起始点 Ampr基因 大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，称为LacZ基因 位于LacZ基因中靠近5-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能,pUC系列的优越性,最通用的大肠杆菌克隆载体之一 优点 具有更小的分子量和更高的拷贝数 构建pUC系列时仅保留了pBR322的复制子和Ampr 具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ基因，适应于组织化学筛选重组体,一、质粒载体,r,pUC18/pUC19质粒载体结构,病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。 分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖改造后,二、噬菌体和病毒载体,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性： 生物结构,l 噬菌体常指大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个bp,COS区: 噬菌体两端存在的12bp的互补序列.,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性： 感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度,缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。 根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0 - 14 kb,（51 37）,gt10（插入型）结构,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,Charon 40（替换型）结构,75%105%,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不,利于重组操作，必须删除至1 - 2个,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记,与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434,imm434基因编码一种阻止l-噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源DNA插入到标记基因中，基因灭,活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基,因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产,生蓝色透明斑,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13噬菌体的生物学特性： 生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13 DNA载体的特点：,使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,这在DNA定向突变中非常有用,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混,浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊,斑的混浊度亦越大,但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb,噬菌体或病毒DNA,与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病,毒基因组DNA。,动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病,毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：,单链DNA病毒,双链DNA病毒,单链RNA病毒,双链RNA病毒,RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，,这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。,病毒载体： 一、Ca MV克隆载体 花椰菜花叶病毒组（CaMV） 特点：唯一以双链DNA做为遗传物质的植物病毒，共12种病毒。 在插入外源DNA厚会失去病毒感染性，不能直接感染植物。,二、烟草花叶病毒（TMV）克隆载体 单链RNA，6395bp 特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株植物上快速扩散 常用作植物表达克隆载体,三、SV40克隆载体哺乳动物基因克隆载体 （猿猴空泡病毒40） （一）SV40基因组 双链闭环DNA：5243bp,（二）SV40-DNA复制与增殖 猿猴细胞受纳细胞 嚙齿动物（小鼠、仓鼠）非受纳细胞；细胞癌变 人：12%细胞产生病毒颗粒，不会插入染色体，相对安全,三、穿梭载体（shuttle vector）,带有原核和真核细胞的复制起始点 常将真核生物的克隆载体构建成穿梭载体，使其先在大肠杆菌中扩增，将目的基因与之构成合适的重组体后，再转入真核细胞 若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因,三、穿梭载体（shuttle vector）,真核系统载体还必需具备适当的筛选标记 一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）。 另一种普遍使用的是抗新霉素基因。因此，真核克隆载体的构成一般由来自噬菌体、质粒和病毒的DNA元件构建而成。,三、穿梭载体（shuttle vector）,（二）逆转录病毒载体,（一）SV40（猿猴病毒）载体,（一）SV40（猿猴病毒）载体,真核表达载体中的调控元件大都来源于SV40的调控顺序和复制信号 用SV40作为载体有两种方式 用SV40 DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒； 重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。,三、穿梭载体（shuttle vector）,例：PSVK3质粒,PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。,三、穿梭载体（shuttle vector）,PSVK3具有下列构件： 原核系统构件：复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl;筛选标志（Ampr）；启动子（T7启动子）。 真核系统构件： SV40复制起始点；SV40早期启动子 RNA修饰信号：SV40小T抗原拼接信号；SV40早期区mRNA polyA加尾信号。 多克隆位点：SV40启动子下游有8个酶切位点。,三、穿梭载体（shuttle vector）,pSVK3质粒,（二）逆转录病毒载体,逆转录病毒载体具有几个特点 具有广泛的哺乳动物细胞宿主 较大的容量，能插入7kb大小甚至更大的外源基因,三、穿梭载体（shuttle vector）,病毒基因组自身含有完整高效的调控元件 病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在 逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系,逆转录病毒载体的局限性： 逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞； 装载容量较小，仅8kb左右，不适用于较大的基因； 安性问题，最大的危险是制剂过程中可能存在具有复制能力的野生型病毒,三、穿梭载体（shuttle vector）,常用外源DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，称为卸甲载体（disarmed vector）。,四、人工染色体 (artificial chromosome),酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（BAC） 噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC） 哺乳动物人工染色体（MAC）,YAC主要调控元件,着丝粒 保证染色体细胞分裂过程中正确分配到 子代细胞 端粒 防止染色体被核酸外切酶降解的功能 复制起始点和限制性酶切位点,四、人工染色体,筛选标记 YAC载体的两臂均带有选择标记，在酵母中选择标记一般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选 原核序列及调控元件 包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作,YAC作为载体的主要特点,酵母是单细胞真核生物，培养方便； 酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因； 装载容量巨大，可达Mbp水平；,四、人工染色体,YAC的克隆程序相似于基因组DNA的常规克隆；DNA在片段连接到YAC载体的（两）臂上形成重组体，随后该重组体可通过常规方法导入酵母； 已广泛应用于各种生物基因组计划。,质粒,质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,质粒,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,质粒,质粒DNA的分离纯化,碱溶法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,质粒,质粒DNA的分离纯化,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,考斯质粒与噬菌粒,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和,1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，,考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA,的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，,就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序,列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时,又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这,便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒,和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内,不能形成噬菌体颗粒。,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建：,考斯质粒是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site - carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为31 - 45 kb,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒载体的特点：,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子,以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体,能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞,装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119,pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG,pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118 / 119,表示M13辅助噬菌体DNA,考斯质粒与噬菌粒,噬菌粒（phagemid or phasmid）,重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体,pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外,源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存,在下，又可实现外源基因,的体外转录,人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人造染色体（BAC）,酵母人造染色体（YAC）,人造染色体载体,细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建：,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350 - 400 kb,人造染色体载体,酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）,酵母人造染色体的使用：,E