重症急性胰腺炎大鼠IL8IL10及NFκB的表达.doc

重症急性胰腺炎大鼠IL-8 IL-10及NF-B的表达 作者：金牡丹 周智林 傅志泉【摘要】 目的 通过观察重症急性胰腺炎（SAP）大鼠白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）及胰腺NF-B的表达，探讨重症急性胰腺炎的发生发展机制。方法 将40只大鼠随机分为正常对照组（假手术组）、模型组（重症急性胰腺炎组），每组20只，造模后24h测定血淀粉酶、IL-8及IL-10，切取相同部位的胰腺组织观察组织病理学改变，进行NF-B的免疫组织化学染色。 结果 模型组大鼠血清淀粉酶、IL-8及IL-10的浓度均显著高于对照组，模型组NF-B免疫组化染色较对照组显著增强。 结论 IL-8、IL-10及NF-B在重症急性胰腺炎的发生发展中起重要作用，重症急性胰腺炎的早期即有胰腺组织NF-B的活化。 【关键词】 重症急性胰腺炎 白介素-8 白介素-10 核因子-B【Abstract】 Objective To investigate the expression of nuclear factor-kappa B (NF-B), serum interleukin-8 (IL-8) and interleukin-10 (IL-10) in severe acute pancreatitis (SAP) in rats .And to investigate the roles of activated nuclear factor-kappa B (NF-B) and serum IL-8 and IL-10 in SAP. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into normal control group (Sham operation group) and model group (SAP group). There were 20 rats in each group. Levels of serum amylase, IL-8, IL-10 and activated NF-B in the pancreatic tissue were detected 24 hours after operations. Results The levels of IL-8 and IL-10 in serum SAP were significantly higher than those in normal control group. Activated NF-B was enhanced in SAP group compared with Sham operation group. Conclusions IL-8, IL-10 and NF-B play an important role in severe acute pancreatitis. There was activated NF-B at the early stage of severe acute pancreatitis.【Key Words】 Severe acute pancreatitis Interleukin-8 Interleukin-10 Nuclear factor-kappa B 重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）是由多因素诱发、多个脏器受累、病情凶险、发展迅速、病死率高的内科急重症，而多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）或者多器官功能衰竭（multiple organ failure, MOF）是SAP的主要死亡原因。损伤因子（如异常激活的胰酶）导致各种炎症细胞的过度激活，形成亢进的免疫反应，并释放多种炎性介质，启动全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS），在机体受到促炎细胞因子损伤引起SIRS的同时，机体的防御系统也随之发生反应,合成并释放抗炎细胞因子，引起代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)。无论失控的SIRS，还是过度的CARS，均表现为机体致炎-抗炎因素的失衡，机体稳态破坏，均可导致炎症损害加重。在SAP时，大量细胞因子产生，促炎因子和抗炎因子共存，其中包括促炎细胞因子IL-8和抗炎细胞因子IL-10。核因子-B（nuclear factor kappa B, NF-B）活化是众多炎症介质作用机制的共同通道，诸多炎症因子在基因水平上都受到NF-B的调控。作者自2006年8月至2007年3月通过建立大鼠重症急性胰腺炎模型，观察血清中IL-8、IL-10的变化以及胰腺NF-B的表达，探讨重症急性胰腺炎的形成机制。1 材料和方法1.1 动物及分组 40只Wistar大鼠（购自浙江省医学科学院），体重250300g，随机分为正常对照组（假手术组）、重症急性胰腺炎组（模型组），每组20只。各组于术后24h全部处死，留取标本。动物饲养：所有大鼠均给予普通饲料喂养，自由饮水，饲养环境为每笼4只，人工光循环12h/12h，温度为(212.0)，湿度为(552)%。1.2 化学试剂 兔抗鼠的NF-B单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司, 大鼠血清IL-8和IL-10的ELISA试剂盒购自R&D systems。1.3 重症急性胰腺炎模型的制备大鼠术前禁食、不禁水12h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）。无菌条件下取上腹正中切口入腹，寻找胆胰管十二指肠乳头开口，使用一次性静脉留置套管针于对系膜缘肠壁穿刺，进入肠腔后即将针芯退出，将套管经乳头部逆行插入胆胰管约1cm，以无损伤小动脉夹于肝门部阻断胆管后，套管末端接微量泵，以0.1ml/min的速度匀速注入5%牛磺胆酸钠（1ml/kg体重），注毕后拔管，胰腺组织可在短时间内出现充血、水肿，可见包膜下胰腺组织点状或小片状出血，5min后去除小动脉夹，以无损伤缝线缝合肠壁穿刺孔处，关腹。对照组大鼠开腹后仅翻动胰腺数次后关腹。1.4 取材方法 大鼠造模后24h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，经心脏取血，测定血淀粉酶、IL-8及IL-10；切取相同部位的胰腺组织。1.5 分光光度法检测血清淀粉酶1.6 血清IL-8 及IL-10测定（ELISA法） 洗涤液用重蒸水1:20稀释。底物工作液配制：使用前将OPD片放入底物稀释中溶解，每片加液5ml。标准品液配制：使用前每管中加入蒸馏水200l溶解。试剂盒设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100l，第1孔加标准品100l，混匀后用加样器吸出100l，移至第2孔，如此反复作对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔中吸出100l弃去，使之体积均为100l，第8孔为空白对照，建立标准曲线。待测品孔各加入待测样品100ml。将反应板充分混匀后置37 120min。用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向滤纸上印干。每孔加第一抗体工作液1滴，将反应板置37 60min。同前洗板。每孔加酶标抗体工作液2滴，将反应板置37 60min。同前洗板。每孔加入底物工作液2滴，置37暗处反应10min。每孔加入1滴终止液混匀。在492nm处测吸光值。以标准品1000、500、250、125、62、31、 16、0pg/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应IL-8 及IL-10含量。1.7 病理学检查、NF-B测定每个标本切片行HE染色，采用盲法由专科医师在光镜下阅片，每张切片随机选择5个高倍视野，观察胰腺组织病理变化。NF-B免疫组织化学染色，胰腺腺泡细胞及胰岛细胞染色为棕黄色的是NF-B阳性细胞，以积分法半定量描述所取标本的染色情况，每张切片随机观察10个高倍视野，按染色强度分为4级：0 =阴性染色；1=弱阳性染色；2=中度阳性染色；3=强阳性染色；按阳性细胞数占总细胞数的比例分为5级：0=阴性；1=阳性细胞1%25%；2=阳性细胞26%50%；3=阳性细胞51%75%；4=阳性细胞76%100%；每张切片的染色积分以这二者乘积之和表示。1.8 统计学处理实验结果以(xs)表示，用SPSS 12.0统计软件进行分析，首先进行方差齐性检验，然后进行单因素方差分析。2 结果2.1 血清淀粉酶，IL-8 及IL-10的变化模型组大鼠血清淀粉酶、IL-8 及IL-10的浓度均显著高于对照组，差异有统计学意义。见表1。表1 各组大鼠血清淀粉酶、IL-8、IL-10及NF- B水平（略）2.2 各组大鼠胰腺的组织病理学变化胰腺组织学改变：对照组胰腺组织光镜下各时段无明显改变，胰腺腺泡细胞排列紧密，可见胰岛，无中性粒细胞浸润；模型组则见间质水肿，大片腺泡细胞变性坏死，伴有大量粒细胞浸润。对照组大鼠胰腺组织NF-B免疫组织化学染色，腺泡细胞未见阳性细胞，胰岛细胞的胞浆呈淡黄色；模型组可见多数胰腺腺泡细胞胞浆呈棕黄色，胰岛细胞胞浆呈棕黄色，部分胰岛细胞的胞核亦呈棕黄色，染色范围较对照组明显增大，染色强度较对照组明显增强，结果有统计学意义（见表1、图14）。3 讨论 急性胰腺炎是常见急腹症，约10%15%发展为重症急性SAP。其最直接的原因是病程早期出现严重的SIRS及其它系统并发症，如急性呼吸窘迫综合征和MODS。诸多研究己证实炎症细胞过度激活及炎性细胞因子的过度表达导致细胞因子网络失衡在SAP中起着关键性作用，并同上述并发症密切相关。NF-B活化是众多炎症介质作用机制的共同通道，诸多炎症因子在基因水平上都受到NF-B的调控。NF-B是一种具有多向转录调节作用的蛋白，p50/p65异源二聚体是NF-B活化的最常见形式。生理情况下NF-B同其抑制因子（inhibitor of NF-B, IB）结合以无活性状态存在于细胞浆内；疾病过程中，多种因素如病毒、内毒素、氧自由基、TNF-a、IL-6、IL-8等均可使其激活，NF-B由胞浆进入核内，与其靶基因上的启动子或增强子结合，进而调控多种细胞因子和免疫介质的表达，进一步放大炎症反应，促炎因子和抗炎因子共存,其中包括促炎细胞因子IL-8和抗炎细胞因子IL-10。1997年Dunn等首先发现NF-B的活化是AP发生中的重要早期事件，随后Altavilla等发现雨蛙素诱导的大鼠水肿性AP胰腺组织中NF-B的活性在疾病的早期有明显的升高。Osman等把IL-10类似剂应用于实验性AP动物模型后，发现血清TNF-a和IL-8水平下降，腹水量减少，中性粒细胞浸润和趋化以及肺组织CD11B/CD18阳性细胞功能明显受到抑制，生存率明显改善。在体外试验中，Olivier发现IL-10可以通过抑制IB激酶复合体来抑制NF-B的活性，从而减少支气管上皮细胞中IL-8的表达。本研究表明在重症急性胰腺炎的早期胰腺组织即有NF-B的活化，IL-8，IL-10及NF-B在重症急性胰腺炎的发生发展中起重要作用，重症急性胰腺炎时机体致炎-抗炎因素失衡，IL-10可能有助于促进致炎-抗炎因素的平衡，减轻重症急性胰腺炎时的炎症反应。【参考文献】 1 Bone RC. Sir Isaac Newton, sepsis SIRS and CARS. Crit Care Med, 1996, 24: 11251128.2 Wereszczynska-Siemiatkowska U, Dabrowski A, Siemiatkowski A, et al. Serum profiles of E-selectin, interleukin-10, and interleukin-6 and oxidative stress parameters in patients with acute pancreatitis and nonpancreatic acute abdominal pain. Pancreas, 2003, 26(2): 144152.3 Dunn JA, Li C, Ha T, et al. Therapeutic modification of nuclear factor kappa B binding activity and tumor necrosis factor-alpha gene expression during acute biliary pancreatitis. Am Surg, 1997, 63(12): 10361043.4 Altavilla D, Famulari C, Passaniti M, et al.Lipid peroxidation inhibition reduces NF-kappaB activation and attenuates cerulein-induced pancreatitis.Free Radic Res， 2003，37(4):425435.5 Osman MO, Jacobsen NO, Kristensen JU, et al. IT 9302, a synthetic interleukin-10 agonist, diminishes acute lung injury in rabbits with acute necrotizing pancreatitis. Surgery, 1998, 124(3): 584592.6 Taba