青海高原地区胃癌患者MICA基因在mRNA及其蛋白水平表达.doc

青海高原地区胃癌患者MICA基因在mRNA及其蛋白水平表达 作者：张晓岩, 杨生玺, 吕同德, 哈小琴, 王海燕, 耿排力【摘要】 目的：研究青海高原地区胃癌组织中MICA基因在mRNA水平与其蛋白表达及相关关系. 方法：采用RTPCR技术检测41例高原地区胃癌组织和相应的癌旁粘膜组织中MICA mRNA表达，采用免疫组化SP法检测MICA蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达，Spearman相关关系检验分析它们之间的相关性. 结果：青海高原地区胃癌组织MICA mRNA的表达水平高于癌旁组织（P<0.05）. 胃癌组织MICA蛋白表达在癌旁组织中为(26.9%,11/41)与胃癌组织阳性率为87.8%(36/41),高分化组(75.0%,6/8),中分化组(83.3%,10/12),低分化组(95.2%,20/21),之间差异有统计学意义(P<0.05),而与肿瘤发生的性别、年龄、淋巴结转移无关（P>0.05）. Spearman相关分析显示， MICA蛋白表达水平与mRNA的表达水平呈正相关（P<0.01）. 结论：MICA的过度表达在青海高原地区胃癌的发生发展过程中起着重要作用，胃癌组织中MICA mRNA以及蛋白水平的升高之间存在密切正相关. 【关键词】 高原;胃肿瘤;MHCI类链相关蛋白A 【Abstract】 AIM: To detect the expression of MICA at the mRNA and protein levels in gastric cancer patients in the plateau area of Qinghai and explore their correlation. METHODS: Semiquantitative RTPCR assay was used to detect the expression of MICA mRNA and SP immunohistochemistry to detect the expression of MICA protein in 41 patients with gastric cancer. Spearman rank correlation was used to analyze the correlation between them. RESULTS: MICA mRNA levels in gastric cancer were significantly higher than those in neighboring noncancerous tissue （P<0.05）. The expression of MICA protein showed a significant difference between the gastric carcinoma tissue (87.8%, 36/41) and the neighboring noncancerous tissue (26.9%, 11/41), among the high ( 75.0%, 6/8), the moderate (83.3%, 10/12) and the low differentiation (95.2%, 20/21) (P<0.05). The expression of MICA was not correlated with sex,age and lymph node metastasis of the patients （P>0.05）. Spearman rank correlation displayed that the expression of MICA mRNA was positively correlated with the MICA protein level (P<0.01). CONCLUSION: The overexpression of MICA may play an important role in the development and occurrence of gastric cancer in the plateau. The upregulation of MICA mRNA expression is closely correlated with the increase of MICA protein level in gastric cancer. 【Keywords】 plateau; gastric cancer; MICA0引言 青海省是我国胃癌高发地区之一，其胃癌病死率居全国之首，达406210万1. 高原环境下长期慢性缺氧是重要的应激因素2，也是导致一些高原地区某些疾病高发的可能原因. MHC I 类链相关蛋白A (major histocompatibility complex class I chainrelated protein A, MICA)是由位于人类第六号染色体短臂6p21.31的HLA复合体中的MICA基因编码的非经典HLA I类分子. MICA通过与C型凝集素样活化性受体N KG2D的结合, 影响多种免疫效应细胞功能表现. 该分子在多数正常组织中并不表达, 但在癌变、感染、应激时表达水平明显增加, 其与病毒感染及肿瘤关系一直是人们较为关注的问题3 . 本研究拟对青海高原地区胃癌患者MICA基因表达的研究，进一步探讨高原地区和慢性缺氧环境中胃癌患者机体免疫的分子机制奠定理论基础. 1材料和方法 11材料青海大学医学院附属医院肿瘤科200510/200604手术切除并经病理证实的新鲜胃癌标本41例，患者居住高原30年以上,术前未做放疗和化疗. 同时距肿瘤边缘510 cm以上切取癌旁组织作为对照.标本离体后5 min内即投入液氮罐并转至-70冰箱冻存.男26例，女15例，年龄3576岁. 黏液腺癌5例，腺癌36例.高分化8例，中分化12例，低分化21例(有27例发生淋巴结转移). RNA提取用TRIzol试剂一步法提取总RNA, 逆转录聚合酶链反应试剂盒TaKaRa RNA PCP Kit Ver. 3.0(TaKaRa公司产品), DNA2000（购自上海生工）.琼脂糖（Agarose）购自大连宝生物公司.山羊抗人MICA单克隆抗体（购自R&D公司），生物素链霉素抗生物素蛋白检测系统(SP)试剂盒购自北京中杉公司. 依据文献设计引物 4-5 MICA(NM, 2000247)，内参照actin (BC,2016045)，引物均由大连宝生物公司合成(表1).表1MICA和act in引物 12方法 1.2.1MICA的RTPCR检测从-70冰箱中取出冻存的新鲜组织(癌及癌旁组织)100 mg，采用Trizol法提取组织总RNA，测定总RNA浓度及纯度.使用Takara的MMLV Rtase cDNA synthesis Kit(codeD6130)反转录合成cDNA的第1链，接着合成第2链（均照说明书操作）.将所得10 L产物冻存于-20以备进行PCR. PCR反应体系50 L，包括5Buffer 10 L, Taq DNA酶0.2 L，目的引物MICA上下游各1 L，actin引物上下游各1 L，cDNA模板10 L，无菌水25.8 L. 反应条件：94预变性5 min；94变性45 s,退火温度55 60 s，72延伸60 s，35个循环；72 10 min后终止反应. PCR产物于15 g/L的琼脂糖凝胶做电泳,以无菌水代替cDNA模板的PCR管为阴性对照，天能凝胶成像系统对电泳条带拍照并进行半定量分析. MICA mRNA相对表达量以同一反应体系中目的产物电泳条带密度指数与内参对照actin电泳条带密度指数的比值来表示. 1.2.2MICA免疫组化染色取出冻存的新鲜标本迅速置于40 g/L甲醛中固定，制成石蜡块.先行HE染色确定诊断,取标本无出血、坏死区域,组织厚度3 连续切片,MICA稀释浓度5 g/mL,SP法染色，用山羊血清代替一抗作阴性对照，阳性对照采用已知阳性切片.DAB作底物显色,苏木素复染核,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树脂胶封片,显微镜下观察. MICA判断标准6:阳性细胞胞膜和胞质呈棕黄色颗粒着色,阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数<5%；阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数的范围为5%25%；阳性()为肿瘤组织阳性细胞数的范围为>25%50%；阳性()为肿瘤组织阳性细胞数>50%. 统计学处理: 数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量资料以xs表示，两组间比较采用t检验.多组间比较用方差分析及LSDt检验计数资料组间率的比较采用卡方检验，RTPCR结果和免疫组化结果的相关性采用Spearman等级相关分析，按=0.05的水准判断是否具有统计学意义. 2结果 21RTPCR结果MICA mRNA在胃癌组织中的表达水平有差异（表2，图1）.表2胃癌组织MICA mRNA及蛋白的表达与临床病理 22免疫组化染色癌旁组织MICA免疫组化染色11例(26.85%)（图2）；癌组织中36例（87.8%），其中(+)9例，()20例，()7例. MICA表达与分期有相关，高分化、中分化、低分化阳性率分别为75%(6例/8例)、83.3%(10例/12例)、95.2%(20例/21例).组间差异具有统计学意义(P<0.05).无转移者MICA阳性率为85.7%(12例/14例),有转移者阳性率为88.8%(24例/27例),两者差异无统计学意义（表2）. 23MICA mRNA表达与MICA蛋白水平Spearman等级相关分析显示,胃癌组织中MICA表达水平与MICAmRNA的表达水平呈正相关(rs=0.907, P<0.01). 3讨论 高原低氧是一种环境致病因子，机体对低氧的应激反应异常是导致各种高原适应不全和高原疾病的重要因素7. MICA属于MIC基因家族.正常情况下仅表达于上皮细胞、内皮细胞等表面.而在组织细胞受到过度应激(如热休克、紫外线等)的情况下会诱生表达或上调表达8 . Pende等9发现, MICA在大多数上皮来源的肿瘤细胞(肺癌、乳腺癌等)和部分黑色素瘤细胞中均有表达并被认为与恶性转化相关.研究表明,NK细胞和CD8+ T细胞能够消除高度表达NKG2D配体MICA的肿瘤细胞,并在小鼠肿瘤模型中激发起针对该肿瘤细胞系的抗肿瘤免疫应答10-11. Groh等的研究表明, sMICA能诱导T细胞表面NKG2D的内化和降解,并发现在胃肠恶性肿瘤患者的血清中含高水平的sMICA分子，从而认为是这些从肿瘤细胞表面释放的可溶性MICA分子导致了NKG2D的下调,并进一步严重影响了抗原特异性T淋巴细胞的反应性12. sMICA通过限制活化信号的传递,对机体抗肿瘤免疫应答的负调作用是肿瘤发生免疫逃逸的机制之一. 我们用RTPCR法检测了高原胃癌患者胃癌和癌旁组织中MICA mRNA的水平，同时用免疫组化法检测了MICA蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达. 结果表明，MICA mRNA在癌组织中的表达水平高于癌旁组织,它的表达水平与与肿瘤部位、性别无关. Spearman等级相关分析显示，MICA蛋白表达水平与mRNA的表达水平呈正相关，相关系数分别为(rs=0.907, P<0.01).这表明在高原低氧条件下，胃癌组织中基因MICA以及与其蛋白水平的升高之间具有一定地相关性. MICA的过度表达在胃癌的发生发展过程中起着重要作用，MICA高表达的癌组织其恶性程度也越高. 提示MICA的表达可反映胃癌的生物学行为，有可能作为判断胃癌分化程度、和预后的有价值指标之一. MICA是一种可受应激诱导的蛋白质分子, 其表达形式和水平的变化与机体免疫功能, 尤其是抗肿瘤抗感染免疫功能密切相关.我们首次检测青海高原地区胃癌患者MICA基因在mRNA和蛋白水平的表达，在高原低氧环境中,细胞可能受到低氧应激条件的刺激,诱发表达上调. 目前, 在其结构与功能, 以及与疾病关系等方面的研究都取得重要的进展, 但对其在高原低氧条件下表达调控机制的研究却很少, 尚有许多问题需要进一步研究.【参考文献】 1 马颖才,熊元治,杨卫红，等.青海省胃癌高发区幽门螺杆菌特异蛋白与胃癌的关系J. 临床床荟, 2004,19(6):329-330.2 Magalhaes J, Ascensao A, Soares JM,et al. Acute and severe hypbaric hypoxia increases oxidative stress and impairs mitochondrial function in mouse skeletal muscleJ. J Appl Physiol, 2005,99(4):1247-1253.3 Raulet DH. Roles of the N KG2D immunoreceptor and its ligandsJ. Nat Rev Immunol, 2003, 3(10): 781-790.4 Molinero LL, Gruber M, Leoni L, et al. Upregulated exp ression of M ICA and proinflammatory cytokines in skin biopsies from patients with seborrhoeic dermatitisJ. Clin Immunol, 2003, 106(1): 50.5 Yamamoto K, Fujiyama Y, Andoh A, et al. Oxidative stress increases M ICA and M ICB gene expression in the human colon carcinoma cell line (CaCo2 ) J. Biochim Biophys Acta, 2001, 1526(1): 10.6 任学群，孟继明，傅侃达，等. 缺氧诱导因子1的表达及微血管密度与结直肠癌生物行为的关系J. 第四军医大学学报, 2004，25（8）:721-724.7 Kim JJ, Thompson RF . Cerebellare circuits and synaptic mechanisms involved in classical eye blink conditioning J. TINS, 1997,20(4):177. 8 Groh V, Bahram S, Bauer S, et al. Cell stressregulated human major histocompatibilit complex class I gene expressed in gastro intestinal epitheliumJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(22): 12445-12450.9 Pende D, Rivera P, Marcenaro S, et al. Major histocompatibility complex class Irelated chain A and UL16binding prote