《基因工程四要素》PPT课件.ppt

第二节 基因工程四大要素,四大要素解决5大操作元件的几个问题,1、用什么来”切“？”切“什么？ 2、用什么来”接“？”接“什么？ 3、”转“入哪里？ 4、怎样“增”？ 5、怎样“检” ？,人工合成、酶切、PCR、文库、cRNA,重组产物,目的基因,克隆载体,连接,重组DNA分子,细菌中原核表达,在植物中表达（转基因植物）,在酵母中表达,病毒中表达,分离纯化,上游技术,下游技术,酶切,酶切,转化感受态宿主细胞,目的基因被克隆增殖,构建其表达载体,转化感受态宿主细胞,PCR和酶切鉴定,Southern Northern Western 筛选检测鉴定,工具酶 载体 目的基因 受体,四大 要素,一、工具酶 （一）限制性内切核酸酶 P21 1、概念,一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。,限制与修饰系统： 限制（Restriction） 将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断;修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割,由1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 1、用酶源生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoR I，EcoR V。,命名原则？P21,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶 I 类限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶,限制与修饰系统的种类？P21,识别的长度,切割的位点P22,识别的结构,2、限制性内切核酸酶识别序列P21,书写：以5 3”走向的单链DNA核苷酸表示,左右互补,同裂酶：P22,来源不同， 识别序列相同， 酶切位点相同或不同。,1、黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（5粘性和3粘性）,3、切割方式P22,同尾酶：P22,内切酶切割的位点不同，但具有相同的黏性末端，这一组酶成为同尾酶。,平末端：,4、应用 （1）限制酶切割位点提供了DNA物理图谱的特异性标记 （2）酶切产生的特异性片段可用分子克隆的手段加以纯化 （3）酶切产生的片段为各种各样的其他DNA酶学操作提供了基本底物。,5、DNA末端长度对限制酶切割的影响,限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求,对引物设计的指导：在引物末端加上一定数目的碱基数目,体现内切的特征 加尾操作,(二)DNA连接酶:P25,作用：可以把两种来源的DNA（用同一种限制 酶切割）的黏性末端黏合起来。（以下几种情况）,同裂酶，行不？P25,失去了两种酶的识别序列,酶的识别序列仍存在,35磷酸二酯键,两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端 （2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平末端 功用：DNA重组中促使载体与DNA连接,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割（“分子剪刀”或“分子手术刀”“基因刀”之称 ） 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接,（三）其它工具酶： 1、甲基化酶：-来自细菌防御系统 甲基化对限制酶切的影响 （1）、修饰酶切位点-使本可被酶切的不受酶切 （2)、产生新的酶切位点使本不能被酶切的能被酶切 (3)、对基因组作图的影响,2、DNA聚合酶(DNA polymerase)来自DNA复制系统 催化DNA的合成活性（主要活性）：把dNTPs连续地加到引物的 3OH端，催化核苷酸的聚合作用。（聚合酶的共同特点） 其他活性（相辅助的活性）,3、耐热DNA聚合酶 来源：噬高温的细菌。 基本特性：在高温下具有活性（90-100） 用途：主要用于PCR,4、反转录酶（reverse transcriptase） 依赖于RNA的DNA聚合酶（以RNA为模板） 基本特性：5 3合成DNA活性，但无3 5外切酶活性 主要用途：cDNA克隆中合成第一条链/提取RNA反转录成DNA，再PCR（因为内含子的存在）,转录酶-RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5-三磷酸合成RNA的酶。在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关,5、末端转移酶 来源：小牛胸腺 基本特性：不依赖于模板的DNA聚合酶。 应用：P26平末端粘性末端,6、核酸外切酶exonuclease （与核酸内切酶相对应 ） 一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。（作用于DNA或RNA）,单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶,能够从5-末端或3-末端呈单链状态的DNA分子上降解DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+离子的活性酶，是一种耐受性很强的核酸酶。 可以用来测定基因组DNA中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它只切割末端有单链突出的DNA分子。,主要的催化活性是催化双链DNA按35的方向从3-OH末端释放5-单核苷酸。,基因工程应用： P26粘性末端平末端,7、碱性磷酸酯酶： alkaline phosphatase 最适pH在7.0以上，催化各种磷酸单酯键水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖的酶，也可以催化磷酸基团的转移反应，但不能水解磷酸二酯键。 应用：P26,8、RNA酶RNase：,RNase的特点： 抗酸抗碱,具很广pH作用范围 抗高温严寒(065均具活性，100也不能使之完全失活） 抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性） 酶活性不需要辅助因子 存在范围广,总之,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸外切酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 RNA酶-分解RNA 其它酶类-用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等,1、载体：将外源DNA或基因携带入适当宿主细胞（host cell）的工具。,二、基因克隆载体P27,2、载体的种类 克隆载体：携带重组DNA进入在宿主细胞内进行大量复制 形成大量的基因克隆。 被克隆的基因不一定会表达 但一定被大量复制 质粒载体复制起点来自一些天然质粒。 噬菌体载体，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。 人工染色体载体P33：大DNA片段克隆载体 表达载体：使目的基因表达，生产出我们需要的产物。,2、载体具备的条件,具有较高的拷贝数,染色体复制起点 染色体外复制起点质粒,复制起点具种的特异性,分子量过大可转移性低,利于载体的制备,以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞或筛选作用,多克隆 位点,(掌握质粒载体，了解病毒克隆载体、人工染色体载体P28-35) 你对天然质粒了解多少？,（1）可转移性,F质粒：F因子或性因子 R质粒：抗药性因子 Col质粒：大肠杆菌素因子,（2）自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,（3）质粒的拷贝数,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒：1 - 3 拷贝，属低拷贝型，受宿主染色体基因控制 松弛型复制控制的质粒： 10- 60 拷贝，属高拷贝型，受宿主染色体基因控制较弱,（4）标记基因 A、选择标记基因用于鉴别、指示目的DNA（载体）是否进入了宿主细胞（有可能是空载）P2745 。 抗生素抗性基因，使用最广泛。 a.氨苄青霉素抗性基因（Ampr） 杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰细胞分裂，杀死细胞。 Ampr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。,b.四环素抗性基因（Tetr） 抑菌剂，Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合成，细胞停止生长。 四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。,c.氯霉素抗性基因（Cmr） 抑菌剂，Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。,d.卡那霉素(Kanr)、 新霉素(Neor)、G418抗性基因(G418r) 杀菌剂，Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上，导致mRNA发生错读。 来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。,B、筛选标记基因（检测性标记基因） 用于指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子（思考：空载是否生长的问题？）。P27/47,（1） lac Z标记基因-互补：lac Z基因上缺失近操纵基因区段（见下图）的突变体与带有完整的近操纵基因区段的半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。,半乳糖苷酶基因编码1021个 氨基酸 其氨基末端称为链，羧基末端称为链 链负责将链装配为四聚体 单独的链不具酶活性，只有在链的帮助下组装成4才具有酶活性-互补作用 为链编码的基因称之为lacZ(编码146 AAs),载体：许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链（氨基端）的DNA序列lacZ基因。 肽链即是半乳糖苷酶氨基端的短片段,宿主细胞：含有可编码肽链（N端）的DNA序列lacZ基因,+,肽链+ 肽链 半乳糖苷酶有活性,IPTG/x-gal,蓝色菌斑,重组载体+宿主细胞,无肽链，仅肽链 半乳糖苷酶无活性,IPTG/x-gal,白色菌斑,载体转入宿主细胞后,外源基因,抗Amp,抗Tet,抗Amp,抗Amp,抗Tet,抗Tet,重组DNA,空载体,不含有载体或重组DNA,筛选重组子的示意图,怎样得到含重组子的菌？,.,重组体的筛选,外源基因的插入：,.,3、葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 许多生物中没有GUS基因， 95%的大肠杆菌具有GUS基因。 GUS基因作为载体的标记基因，可将底物X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷）降解为兰色产物。 应用：A.用于快速检测植物中GUS基因融合标记。检测本底没有GUS基因的生物（植物），重组子转入植物后，载体上的GUS基因产生的葡萄糖苷酸酶能将加入的底物X-Gluc降解为兰色产物，而对照没有。B.用X-Gluc这种发色底物的培养基可以检测以及定量食品样本如肉、奶制品以及贝类中的大肠杆菌数量。国际上普遍采用该产品取代传统方法以精确检测饮用水中的大肠杆菌数量，该方法大大降低了假阳性和假阴性。,总之，一个克隆载体至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一个用于转化体（重组子和空载）选择，一个用于重组子检测。,3、载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,质粒载体的一般特征,染色体DNA,质粒DNA,大肠杆菌细胞,4、质粒的改造构建 删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细胞) 加入新的遗传标记基因。 引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNA序列：即多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)。 插入特殊的基因表达调控序列。,由pBR322与M13噬菌体改建而成,分子量更小,拷贝数增加,哪两个标记基因？,其它载体： 病毒（噬菌体载体）P30，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体 COS质粒载体质粒载体中插入cos片段，以利于体外包装 噬菌粒载体（phagemid）有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制 人工染色体载体大DNA片段克隆载体P33 体内同源重组整合载体-P35,三、目的基因 （一）定义： 目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。-基因的编码区、也可是包含启动子和终止子的功能基因、完整的操纵子、几个操纵子聚集的基因簇、启动子或终止子元件 （二）来源 ：来源于各种生物，其中主要是真核生物如 人和动物。,（三）目的基因获得途径 1 酶切法 2 PCR扩增DNA 前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物 3 化学合成目的基因-（方法：不要求） DNA片段很长,4、通过构建基因文库或cDNA文库分离目的基因 基因文库：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。 cDNA文库：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库,四、受体细胞 1、含义 所谓基因克隆的受体