Miox基因在爪蟾胚胎发育中的时间和空间表达谱分析.docVIP

Miox 基因在爪蟾胚胎发育中的时间和空间表达谱分析 傅小娟 1，陈雪梅2，周钦3，杜晓刚1* 1，重庆医科大学第一附属医院肾脏内科，重庆 400016 2，重庆医科大学第一附属医院急诊科，重庆 400016 3，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室遗传工程与小鼠中心，成都 610000 摘要摘要 目的目的 研究 Miox 基因在物种进化及爪蟾胚胎发育过程中的时间和空间表达的分布特点。方法方法 利用半定 量 RT-PCR 观察 Miox 在爪蟾胚胎发育过程中的时间表达模式，利用整体原位杂交的方法（WISH）观察 Miox 基因在爪蟾 胚胎发育过程中的空间表达模式。 结果结果 RT-PCR 结果显示 Miox 基因在胚胎发育第 26 期以前都没有表达，到胚胎发育 第 28 期开始有微量表达，随着胚胎的发育表达量逐渐增高，到胚胎发育第 40 期 Miox 表达明显升高，在第 41 期表达最高， 到胚胎第 45 期表达有所下调。与胚胎第 28、34 期相比，第 40、41、,45 期表达明显上调(P0.05)；与胚胎第 40 期相比， 第 41 期表达明显上调(P0.05)；然而，同胚胎第 41 期相比，第 45 期表达又明显下调(P0.05)。WISH 发现在 30 期以前 都没能检测到 Miox 在爪蟾的任何器官有表达，但从 33 期开始， Miox 在爪蟾前肾有很微弱的表达， Miox 的表达随着发 育的进展逐渐增高。WISH 结果同 RT-PCR 结果相类似，直到第 3940 期，Miox 的表达量才明显升高，并且在随后的时 期都以同样高的水平表达。另外我们还发现，Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中均仅仅在原肾小管表达。结论结论 Miox 是一 个肾脏特异性基因，对于研究肾脏发育可能提供一个特异性标记。 关键词关键词 Miox；爪蟾；肾脏发育；表达模式 中图分类号中图分类号 R 394.1 文献标识码文献标识码 A Identification the Temporal and Spatial Expression Patterns of Miox in the Evolution of Xenopus laevis Embryos FU Xiao-juan1，CHEN Xue-mei2，ZHOU Qin3,DU Xiao-gang1* 1. Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China 2. Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China 3. Core Facility of Gene Engineered Mice, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610000,Sichuan,China Abstract Objective To identify the molecular evolution of Miox and its temporal and spatial expression patterns in the evolution of Xenopus laevis embryos. Methods The temporal and spatial expression patterns were analyzed by semi-quantitative reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) and whole-mount in situ hybridization, respectively. Results We investigated the temporal expression pattern of Miox during embryogenesis of Xenopus laevis by RT-PCR and found that hardly any expression was detected before stage 26. Miox firstly expressed at stage 28 with a very small amount. Its expression level gradually increased along with the development of the process and reaced its peak at stage 40 and kept a high stable level in later period. Compared with stage 28,34,the expression of stage 40,41,45 were upregulated significantly(P0.05) .Compared with stage 40,the expression of stage 41 was upregulated markedly(P0.05).But compared with stage 41,the expresssion of stage 45 was downregulated(P0.05).The results of 基金项目基金项目 国家自然科学基金(81202318，81370816),国家重点基础研究发展计划(“973”计划，2011CB944002)，重庆自 然科学基金(cstc2012jjA10136).Supported by National Natural Science Foundation of China (81202318，81370816), National Key Basic Research Program of China (“973” Project，2011CB944002),Natural Science Foundation of CQ CSTC (No.cstc2012jjA10136). 作者简介作者简介傅小娟,硕士生.E-mail: *通信作者通信作者（Corresponding author）.TelE-mail: Comment t1: 换算为 1000g Comment t2: 换算为 1000g Comment t3: 换算为 1000g whole-mount in situ hybridization showed that Miox started express at stage 33 and the expression trend was consistent with RT- PCR. We also found that Miox only expressed in the pronephros tubules in the whole procss of embryo development. Conclusion Miox was tissue-specific in Xenopus laevis pronephros development, which may provide a marker for later pronephros development in the study of organogenesis. Key wordsMiox; Xenopus laevis; kidney development; expression pattern 肌醇加氧酶(Myo-inositol oxygenase,Miox) 最初是在大鼠肾脏提取物中发现并纯化,但是从大鼠肾脏分 离得来的Miox蛋白并不稳定，因此关于这个蛋白的机制及特性研究进展很慢。直到20世纪80年代，有人 用电泳分离的方法才得到纯度较高的蛋白1。肌醇(Myo-Inositol,MI)是生理肌醇的异构体，在许多组织和 细胞中作为第二信使合成的前体而被利用，同时还可以作为一种有机渗透物质参与渗透压调节2。MI代 谢的第一个限速步骤就是受到Miox这个单氧酶的催化，而这个过程主要在肾皮质的近端小管发生3。 Miox催化MI分解的酶促反应主要氧化裂解MI环状分子的第6位和第1位碳原子之间的键并产生D-葡糖醛酸 (D-glucuronic acid)，形成的D-葡糖醛酸在随后的一系列步骤中逐步分解，并最终进入磷酸戊糖途径进行 循环代谢。研究发现，Miox在小鼠肾小管中近端小管表达明显高于其他器官。此外，Miox在糖尿病并发 症器官(如神经组织、视网膜等)中也有少量表达4-7。然而关于Miox在胚胎发育中的作用至今尚未见报道。 本研究通过半定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和整胚原位杂交的方法观察Miox在爪蟾胚胎发育过程 中的时间和空间表达谱，为以后研究Miox在肾脏发育过程中的作用提供理论基础。 1材料和方法 1.1 主要试剂 实验所需爪蟾由四川大学华西医院遗传工程小鼠中心馈赠。RT-PCR试剂盒、HindIII 和BamHI限制 性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、T3和T7 RNA聚合酶均购于Fermentas公司。地高辛标记的 UTP、Anti-digoxigenin-AP及Purple AP Substract均购于罗氏公司。 Trizol购于Invitrogen公司，PCR 引物 合成和DN A 测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。羊抗地高辛碱性磷酸酶标记的抗体及封闭 用正常羊血清购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.2 爪蟾胚胎的获取及制备 向成熟的非洲爪蟾背部注射500800 IU的人绒毛膜促性腺激素(HCG)促进排卵。体外受精后的胚胎， 用2%的盐酸半胱氨酸(pH 7.88.0)进行脱膜，将脱膜以后的受精卵培养在0.1 MBS ( pH 7.4)缓冲液中。 用于原位杂交的胚胎将固定于1 MEMFA缓冲液+3.7%多聚甲醛(固定11.5 h)。固定后的胚胎经过不同 浓度甲醇处理（25%的甲醇处理5 min， 50%的甲醇处理5 min， 75%的甲醇处理5 min， 100%的甲醇处 理5 min） ，梯度脱水。 。脱水后的胚胎保存在-20的冰箱中。 1.3 RT-PCR检测Miox表达 分别收集爪蟾第1、3、7、11、17、20、22、26、28、34、38、40,、41、45期共14个时期的胚胎，将 收集的胚胎放入研钵，加入少量液氮迅速研磨，将研磨的组织转入1.5 mL 离心管，按50100 mg组织 /mL Trizol,反复吹打，室温放置5 min使其充分裂解；4离心机1000g离心10 min；将上清液转移到新的离 心管中，加入200 uL氯仿(按照200 uL氯仿/1 mL Trizol比例),振荡混匀，室温放置15 min；4离心机1000g 离心15 min；离心后可以看到混合物被分为3层，吸取上层水相至一新的离心管中；加入500 uL异丙醇(按 照500 uL异丙醇/1 mL Trizol的比例)混匀，室温放置510 min；4离心机以不超过1000g的速度离心10 min，此时在管底可见微小白色沉淀，丢弃上清液；加入1 mL 75%乙醇(按照1 mL 75%乙醇/mL Trizol比例)， 温和振荡悬浮沉淀；4离心机以不超过7500g的速度离心5 min，丢弃上清；重复一次；室温干燥RNA 510 min，用30 uL DEPC水溶解沉淀，测定浓度并放置在-20保存。将RNA反转录为cDNA，采用PCR Comment t4: 用 Image J 对凝胶图像 进行灰度扫描，并进行统计学分析 Comment s5: 冠状位切片 Comment s6: 在 ZEISS AxioCam MRc5 体视镜下观察并拍照。 扩增包含大部分编码区及部分3端非翻译区的Miox基因cDNA序列( 扩增片段长度为896 bp)。引物序列(上 游引物5GCAAGCTTGTGTTCAGTGACACCA3，下游引物 5GCGGATCCAATCTTCACAATCCTC3)。 扩增条件: 95预变性2 min；94变性30 s, 55退火30 s, 72延伸 1 min, 共35个循环；最后72 延伸 10 min。将扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统下观察基因在各个时期的表达情况。用 Image J对凝胶图像进行灰度扫描，并进行统计学分析 1.4 胚胎整体原位杂交检测Miox表达 将Miox cDNA的PCR扩增片段克隆在pBST-II载体的HindIII和BamHI多克隆位点之间，并将重组质粒测序 鉴定。将重组质粒经T3 RNA聚合酶体外转录获得反义RNA探针，并用地高辛标记。胚胎整体原位杂交方法 参照Harland 8 报道的方法,在5 mL玻璃小瓶中收集1520个包含胚胎发育各个时期的胚胎，将探针稀释 到杂交缓冲液中，浓度为100 ng/500 uL，并在65水浴锅中孵育过夜。经过一系列洗涤过程，用羊抗地高 辛碱性磷酸酶抗体1:12 000稀释,4孵育过夜。用Purple AP Substract显色底物避光显色，待染色清晰即可 停止染色。在体视镜下观察并拍照。染色后的胚胎经30%蔗糖处理24 h，使用OTC包埋剂包埋胚胎，进行 冠状位切片，切片厚度通常为30 m。切下来的组织转移到圆盖玻片上，放置于24孔板中，90%甘油封片。 在ZEISS AxioCam MRc5体视镜下观察并拍照。 1.5 统计学处理 采用 SPSS19.0 软件进行统计学分析，数据以s 表示，多组资料比较采用单因素方差分析，两组资 料比较采用 t 检验，检验水准（）为 0.05。 2 结果 2.1 Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中的时间表达模式 运用半定量 RT-PCR 检测 Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中的时间表达模式发现,Miox 基因在爪蟾胚 胎发育第 26 期之前都没有表达。当胚胎发育到第 28 期开始有很微弱量表达，随着胚胎发育的进展，在 胚胎发育的第 34 期、38 期表达水平有轻微上调，但是差异并无统计学意义(P0.05)。到胚胎发育第 40 期 Miox 表达明显升高，在第 41 期表达最高，到胚胎第 45 期表达有所下调。与胚胎第 28、34 期相比， 第 40、41、45 期表达明显上调(P0.05)；与胚胎第 40 期相比，第 41 期表达明显上调(P0.05)；然而， 同胚胎第 41 期相比，第 45 期表达明显下调(P0.05)。 图图 1 1 RT-PCR 分析 Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中的时间表达模式 Fig1.Temporal expression patterns of miox in Xenopus laveis embryos at different stages Comment s7: R 和 S 两张图的切片方 向是沿着 J 图和 P 图线轴方向切片。 另外，切片是在体视镜下观察并拍片， 所以不用注明放大倍数 ODC：ornithine decarboxylase；+: with reverse transcription; - : without reverse transcription.*P0.05vs stage 28; P0.05vs stage 34;P0.05vs stage40;P0.05vs stage41. 2.2 Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中的空间表达模式 为了检测 Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中的空间表达模式，我们运用整体原位杂交的方法，结果发 现，在 30 期以前都没能检测到 Miox 在爪蟾的任何器官有表达，但从 33 期开始，我们发现 Miox 在爪蟾 前肾有很微弱的表达，随着胚胎发育的进展，Miox 的表达逐渐增高。同 RT-PCR 结果相类似，直到第 39-40 期，Miox 的表达量达到最高，并且在随后的时期都以同样高的水平表达。另外我们还发现，Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中均仅仅在原肾小管表达， 说明 Miox 是一个肾脏特异性基因，这也许可以为 我们研究肾脏发育提供一个特异性标记。 图图 2 原位杂交检测 Miox 基因在爪蟾胚胎发育过程中的空间表达谱 Fig2. Spatial expression patterns of Xenopus laevis Miox at different stages analyze by whole-mount in situ hybridization. R,S:the direction of section are along the line of J and P,respectively. Pt, pronephros tubule.St ,stage 3 讨论 前肾的发育可以分为以下几个阶段：前肾原基的形成(initiation of pronephric anlage，第 12.5 期)，肾 发生(nephrogenesis, 第 20 期)，细胞定向分化(cellular differentiation, 第 25 期),器官成熟及终末分化 (maturation and terminal differentiation,第 29/30第 35/36 期)，泌尿功能的形成(formation of excretory function , 第 40 期以后)9-10。 间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)在肾脏发育特别是小管发生中发挥着重要作用。 肾脏间充质细胞经过 MET 以后最终分化形成原肾小管。TGF- 就是调节 MET 的一个关键因子11-12。有 研究发现，Miox 的过度表达可以诱导 TGF- 的表达和活性都增加以及间质的一些特异性标记基因如 Vimentin 的表达也增加，同时一些上皮的特异性标记基因如 E-cadherin 的表达下降6，也就是说，Miox 发挥着抑制 MET 过程的作用。另一方面，Miox 是催化肌醇代谢的限速酶。作为一个渗透调节物，肌醇 耗竭可以改变 Na+ /K+ -ATPase5。而 Na+ /K+ -ATPase 在肾脏发育后期功能形成阶段发挥着重要作用， 它通过吸收水分及离子在细胞内外形成电化学梯度从而维持肾脏的渗透调节功能13-14。因此我们推测 Miox 在肾脏发育后期的渗透调节功能发挥着重要作用。 作为一个在肾脏特异性表达的基因，Miox 在肾脏发育过程中发挥的作用迄今还未见报道。我们用 RT-PCR 和整胚原位杂交的方法对 Miox 在胚胎发育过程中的表达作了时间和空间上的表达谱分析。RT- PCR 结果显示，在胚胎发育直到第 26 期，并没有检测到该基因在爪蟾胚胎的表达；直到胚胎发育第 28 期才检测到 Miox 在胚胎前肾有很微弱量表达；随着发育的进程表达量逐渐增高，至胚胎第 41 期 Miox 表 达量达到顶峰，并且在以后的时期以稳定水平持续表达。整体原位杂交结果显示，从胚胎第 33 期才检测 到 Miox 有表达（这可能是因为 RT-PCR 的灵敏度优于整体原位杂交技术） ，并且 Miox 在爪蟾胚胎发育过 程中仅仅在前肾小管表达。从 Miox 的表达模式来看，很可能在肾脏发育的成熟及终分化(29/30 期到 35/36 期)阶段以及肾脏开始排泄功能(40 期以后)发挥着作用，然而这方面还未有研究。 综上所述，本研究第一次在肾脏发育领域观察了 Miox 的表达，分析了 Miox 在经典模式生物爪蟾胚 胎发育过程中的时间和空间表达模式，发现 Miox 在胚胎发育过程中始终都在原肾小管表达。从 Miox 的 表达模式中推测 Miox 基因很可能在肾脏发育的成熟及终分化(第 29/30 期到第 35/36 期)阶段以及肾脏开始 排泄功能(第 40 期以后)发挥作用。Miox 也可能为我们肾脏发育提供一个特异性标记。 4 利益冲突 所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。 志谢 感谢四川大学华西医院遗传工程与小鼠中心的全体成员为本实验提供的支持和帮助！ 参考文献 1 Arner RJ, Prabhu KS, Thompson JT, Hildenbrandt GR, Liken AD, Reddy CC. 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