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miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的 翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs 来源于具有 60-80 个 核 苷 酸 茎 环 结 构 的 microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在 核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品： microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先， 它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴 度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入 细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组 腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广 泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中 得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插 入高达7.5kb的外源基因。pMir-microRNA precursor 是 基于microRNA 前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP 荧光标记，并具有SV40 poly（A ）加尾信号。穿梭载体含有 SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将microRNA前体同源重组到腺病毒载体。microRNA前体腺病毒载体通过在大肠杆菌中同源重组，将microRNA序列 从pEnter和除慢病毒、腺相关病毒之外的大部分的目的载体转移至pAD腺病 毒载体。pAD是最常用的人类腺病毒载体，是人类腺病毒血清5型，E1和E3 基因的缺失。 pAD-ORF质粒可用于在HEK293细胞中包装重组腺病毒。（维真生物，12000个腺病毒现货可第二天发货）microRNA前体腺病毒是microRNA前体的重组腺病毒表达系统。ViGene的预制 microRNA 腺病毒能够最有效地传递 microRNA 前体 ，可应用于microRNA体外和体内的功能研究。产品组成产品主要包括以下部分:1. pMir-microRNA 前体甘油菌液。 100ul.2. pAD-microRNA 前体甘油菌液。 100ul.3. MirAd-microRNA 前体腺病毒。每 100ul 含有108个病毒颗粒保存条件收到产品后，请将所有产品-80C保存。miRNA质粒图谱（维真生物） 质粒扩增pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体的甘油菌液在含30ugml卡那霉素LB固体培养基上活化并37培养过夜。第二天，至少挑取3个克隆进行质粒小 提。用引物GFP-F对pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体进行5端测序，测序位点位于接头上游 85 nt。病毒载体扩增用包括MicroRNA前体腺病毒在内的病毒感染HEK293细胞，对病毒进行扩增。每轮扩增可使病毒滴度增加10倍。注：以下步骤建议使用T75培养瓶，可根据实际情况优化具体参数。1. 转染前一天，在T75培养瓶中接种3-5106 HEK293T细胞。2. 取1/2体积的粗提病毒裂解液至培养细胞中。建议使用PFU（空斑形成单位） 0.5 或足够在48 h内产生病毒细胞病变效应（CPE）的病毒量。3. 感染后24-48 h，每天显微镜下镜检两次，检查单层细胞是否出现细胞病变效应CPE。当CPE接近完成（即大多数细胞圆形但尚未从瓶上脱落），用移液管将瓶上的细胞吹洗至培养液中。4. 收集细胞和培养液。1000 g离心5 min收集细胞。除去上清液，悬浮细胞 用10 mM Tris，pH值8.0，NaCl 100 mM重悬。（T75培养瓶 0.25-0.5ml/瓶）。5. 反复冻融细胞3次释放病毒颗粒。3000g 离心10 min，除去细胞碎片。弃 沉淀，保存上清液中的病毒。6. 病毒上清-80C冻存或立即进行纯化和滴度测定。常见问题解答1. 在使用和操作腺病毒载体时应注意哪些安全性问题？mirAd腺病毒载体是复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，E1和E3基因缺 失。使用腺病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。 应在BL2生物安全二级实验室操作病毒粒子。使用新鲜配制的10漂白粉 进行消毒操作。操作腺病毒和转染细胞时应始终佩戴手套。2. 在什么情况下我该选用腺病毒载体作为将microRNA前体导入细胞的工 具？您应先考虑以下几点：1. 外源基因需要瞬时表达还是稳定的基因表达？2. 需转染分裂细胞还是非分裂的细胞？3.对于靶细胞的潜在免疫原性4.病毒用来进行体内还是体外基因传递？腺病毒载体能感染分裂和非分裂细胞。它适用于体内和体外基因传递，转染效率高，对外源基因瞬时表达量高。但相对于其他病毒载体系统，腺病毒载体在靶细胞中具有相对较高的免疫原性。3. VP，PFU，IFU的区别是什么？我设计的实验该选用哪个指标？VP(Viral particles) 反映了病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒）。由 于在病毒制备过程中，每次死病毒的比率各不相同，VP并不能真实反映 有活性的病毒数量。PFU（plaque formation unit）代表具有感染活性的 病毒数量。通常情况下，VP/PFU比值为20:1至50:1。IFU（infectious unit）相当于PFU。我们建议您选用PFU或IFU作为病毒滴度单位，可获得较为一致的实验结 果。4. 病毒滴度如何测定?测定腺病毒的滴度有三种常用的方法：（1）空斑形成实验 （2）终点稀 释实验 （3）BAC法空斑形成实验是一种检测有感染能力的病毒（PFU）的生物学方法。通常 是用一系列病毒稀释液感染单层HEK293细胞，病毒在感染的细胞中繁 殖，最终导致细胞毒性效应并被释放出来。释放的病毒将感染邻近的细 胞，这整个过程将被不断重复，最终导致空斑的形成。 为了阻止病毒扩散并形成新的空斑，在完成最初感染后，要将一层0.5% 的琼脂铺在细胞表面上。病毒滴度（PFU/ml）可通过统计空斑数目获 得。空斑的形成需3周时间。终点稀释实验类似于空斑形成实验，但更为复杂。病毒滴度的计算公式也 较为复杂。BAC法是检测蛋白浓度，仅适用于纯化后的腺病毒。通常1 ug蛋白=1X109 VP。5. 通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒有必要吗？如果病毒被用于体外细胞实验，不需要进行CsCl双重梯度法纯化。由于未纯化病毒液中含有的细胞碎片和少量培养基成分易诱导显著的免疫学反应，用于体内实验或动物实验的病毒需通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒液，从而除去有缺陷的病毒颗粒和其他培养基中的成分。6. 如何保存重组腺病毒?腺病毒可在-80C条件下，稳定保存6个月至一年。7. mirAd是什么血清型的腺病毒?MirAd 腺病毒是E1/E3基因缺失的人类血清5型腺病毒。8. 什么是RCAs？如何检测 RCAs?HEK293细胞中存在与血清5型腺病毒相同的序列，重组腺病毒与293细胞的重叠序列交叉重组，可产生复制能力的腺病毒（Replication Competent Adenoviruses：RCAs），RCAs发生的几率较小。RCA可使用非辅助细胞，如HeLa进行检测。将梯度稀释的病毒液感染HeLa细胞，并培养8天。8天后，若没有空斑产生，重组的腺病毒则不是有复制能力的腺病毒。9. MirAd microRNA前体的序列是什么?mirAd microRNA前体序列是由primirs（60-80 nts）和150-200 nts的两侧 基因组序