甲基化特异性PCR技术的质量控制及改进.doc

甲基化特异性PCR技术的质量控制及改进作者：顾立萍刘斌,邢传平黄小玲,高自芳苏勤军钱震董亮 【摘要】目的：改进甲基化特异性PCR(MSP)技术并控制实验质量.方法:采用改进的MSP法检测正常胃粘膜及胃癌组织中caveolin1基因的甲基化状况.运用饱和酚氯仿抽提法提取DNA，其中石蜡包埋组织连续切片厚度为8m；采用热启动PCR：反应体系为25L、变性温度设定为95.5、循环数设定为30.结果：新鲜组织较石蜡包埋组织更适于MSP实验，但福尔马林固定石蜡包埋组织同样可用于MSP实验，并且8m厚的石蜡包埋组织能获得较完整的DNA链.热启动PCR效果良好：25L体系敏感性优于50L体系,95.5可以使含CpG岛的DNA链解链更完全,30个循环足以扩增小于150bp的目的片段.结论：采用改进的MSP技术，可获得较好的DNA模板，提高实验的灵敏度和成功率，更适于甲基化的研究. 【关键词】甲基化；聚后酶链反应；DNA/分离和提纯；胃肿瘤 0引言 肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特征，是多基因遗传学和表遗传学共同起作用的结果1.在表遗传学机制中，DNA甲基化研究最多，也是最深入的一种机制.目前，针对DNA甲基化的研究方法中，甲基化特异性PCR（methylationspecificPCR,MSP）技术是最基础和最可靠的方法.现行的实验多采用新鲜组织作为标本来源，但医院病理科保存的大量石蜡包埋组织，是分子生物学研究材料的可靠来源,也是进行回顾性研究的宝贵资源.本研究从石蜡包埋组织及新鲜组织中提取DNA，运用MSP技术对胃癌组织及正常胃粘膜中的caveolin1基因第一外显子CpG岛的DNA甲基化状况进行了检测，并对部分实验步骤进行了调整和改进，取得了较好的效果. 1材料和方法 1.1材料7例正常胃粘膜和37例胃癌组织（6例福尔马林固定石蜡包埋组织、31例新鲜组织）均来自兰州军区总医院病理科200612/200708手术及存档石蜡包埋标本.患者术前均未经辅助放、化疗.MSP试剂盒购于美国CHEMICON公司.caveolin1基因甲基化和非甲基化引物由大连宝生物工程有限公司合成，PCR相关试剂亦购自大连宝生物工程有限公司. 1.2方法 1.2.1新鲜组织及福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA的提取采用传统的饱和酚氯仿抽提法提取DNA2，通过紫外分光光度仪检测DNA含量，选取A260nm/A280nm值在1.82.0的标本，并对DNA的完整性进行检测，选取理想标本进行实验.提取组织冻存于-40.实验主要操作步骤简述如下：石蜡包埋组织切片厚度8m,连续切片8张，经二甲苯（2次）脱蜡，过无水乙醇（2次）；加入DNA消化缓冲液500L(0.1mol/LEDTA,10mmol/LTris,10g/LSDS,调pH8.0)，再加入20g/L蛋白酶K7L并过夜（37，24h）；用酚氯仿（11）法抽提(23次)，沉淀于70L三蒸水中（已消毒）.新鲜组织称取40mg，匀浆器研磨后其余步骤同石蜡包埋组织. 1.2.2DNA甲基化修饰(亚硫酸氢钠修饰)甲基化修饰严格按照试剂盒说明书进行，步骤简述如下：DNA修饰：每个样本取1gDNA溶于100L三蒸水中，加入7L3mol/LNaOH变性处理10min(50水浴)，加入550L试剂（pH5.0)水浴16h(50，避光)；脱盐处理：加入5L试剂（pH5.0）并混匀，加入750L试剂37水浴10min，加入1mL700mL/L乙醇,6000g离心20s,弃上清，共做3次，高速离心2min，吸去剩余悬浮液；完全甲基化（脱磺酸基作用）、二次脱盐、DNA纯化：加入50L20mmol/900mL/L乙醇溶液到标本中，短暂摇匀，37水浴5min，6000g离心20s，加入1mL900mL/L乙醇振荡，再次离心，重复本步骤1次，高速离心2min，吸去剩余悬浮液，室温放置10min，加入TE（pH7.5）缓冲液25L并混匀，60孵育样本15min，高速离心4min，移出混悬液（样品DNA）到新试管，置于-40. 1.2.3MSP根据GenBank中caveolin1基因外显子1的基因序列(AF095591)，采用Prime5.0软件，针对外显子1的启动子CpG岛区域设计并合成引物.甲基化引物：Sense，5gggttcaaagcgggaaaatg3；Antisense，5taggcactccccaaggttct3；非甲基化引物：Sense，5gggtttaaagtgggaaaatg3；Antisense，5taaacactccccaaaattct3，产物大小均为139bp.由于修饰试剂昂贵，故从所提标本中选取最理想的DNA样本进行修饰，其中正常胃组织7例、胃癌标本37例.每份经修饰后的标本均同时用甲基化和非甲基化引物进行扩增，均采用热启动PCR.PCR运用25L反应体系(表1).PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，凝胶成像系统成像.表1PCR反应体系 统计学处理：采用Fisher精确概率法，使用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理,P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1福尔马林固定石蜡包埋胃癌组织中获取的基因组DNA从福尔马林固定石蜡包埋胃癌组织中提取的基因组DNA，大部分已断裂，而且所提DNA的含量较新鲜组织浓度明显降低(图1). 12：DNA大部分断裂；3：提取DNA浓度最高且完整；4：实验失败病例；58：DNA完整.5和6浓度高于7和8. 图1福尔马林固定石蜡包埋胃癌组织中提取的基因组DNA 2.2新鲜胃癌组织中获取的基因组DNA新鲜胃癌组织中DNA断裂现象较从福尔马林固定石蜡包埋组织明显减少，且DNA含量明显提高，经分光光度仪检测,所含蛋白,mRNA,酚等杂质明显减少（图2）. 2.3胃癌中caveolin1基因甲基化状态6例石蜡包埋癌组织中，有5例实验成功，成功率为83%.31例新鲜胃癌标本中，有25例成功，成功率为81%.7例正常胃标本均显示甲基化阴性而非甲基化阳性.30例实验成功胃癌标本中，23例（77%）癌组织检测出caveolin1启动子区CpG岛异常甲基化，其中13例癌组织（43%）表现为完全甲基化；10例癌组织（30%）表现为部分甲基化.癌组织caveolin1甲基化率显著高于正常组织（P<0.01,图3）. 3讨论 MSP技术的成功取决于完整且纯度较高的DNA模板、完全的亚硫酸氢钠修饰、准确且特异的引物、适合的PCR反应体系.采用酚氯仿抽提法提取DNA,每份样本从DNA提取到最终MSP扩增产物用电泳仪检测，大概需要经过5d时间，操作步骤繁多，影响因素甚多，所以MSP技术的难度很大，需严格操作，并适时调整实验条件.但该方法灵敏度高、特异性强，仍是目前DNA甲基化研究方法中最基础和最可靠的方法3-5. 本实验室从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取基因组DNA时，严格操作，并对实验步骤进行了细节性调整，获得了较理想的模板DNA.福尔马林固定后，标本DNA链的脆性增加,受到剪切力时,更易发生随机断裂6;且DNA与蛋白质之间经广泛交联后形成牢固的复合物,阻碍蛋白酶对组织的消化,影响DNA提取7.石蜡组织切片过厚不利于组织脱蜡和蛋白酶消化,过薄则易造成机械损伤,同时切片总面积增加,其表面粘附的PCR抑制因子将可能增多8,我们选择厚度为8m.用蛋白酶K进行消化时，适当地增加蛋白酶K浓度和消化时间，有利于组织消化和DNA的释放.蛋白酶K的工作温度选择37,有利于发挥其活性、并保护DNA的完整性.所有DNA样本均进行完整性检测.从石蜡包埋组织中提取的模板，虽含有少量杂质9，但只要选取理想的模板DNA进行修饰，还是可以取得良好的扩增效果.但从基因组DNA的完整性、含量、纯度来讲，MSP技术应选用新鲜组织用于实验. MSP技术的成败关键在于引物的设计.引物设计原理如下:标本DNA如未发生甲基化，在经过亚硫酸盐处理后,CpG岛中鸟嘌呤则变为尿嘌呤，即CU;如发生甲基化，经过处理后,鸟嘌呤不发生改变10.本实验也曾采用国外学者Engelman等11的caveolin1基因引物序列，PCR产生非特异性扩增（两条杂带、一条引物二聚体），并且目的条带的产量也较其他非特异性扩增产物少.随后，我们采用Prime5.0软件重新针对caveolin1基因外显子1之前的CpG岛区域设计引物序列，得到139bp的目的条带，仍有非特异扩增，但扩增产物中以目的条带含量最多.建议设计好引物后(一般引物大小为1530bp为宜)，必须在PUBMED基因库中进行比对,保证引物与基因特异结合，产生特异的扩增产物.扩增产物大小最好在150bp以上，以便于测序. DNA双链中总是存在非甲基化的胞嘧啶，使得修饰后的DNA双链不再完全配对，容易形成二级结构，PCR扩增时不易解链.因而我们采用热启动法进行PCR扩增：预变性之前，不加入Taq酶，在预变性之后再加入酶（温度保持在95.5）.并将常规的变性温度由94.0提高至95.5，既不会使Taq酶失活，又使DNA双链解链完全（Taq酶在92.5，95，97.5的半衰期分别为130，40，56min）.实验发现，对于扩增较小的DNA片段，设置3040个循环，扩增产物的量并无明显差别，为节省操作时间，宜选取30个循环.25L体系敏感性优于50L体系,而且节省试剂. 由于亚硫酸氢钠修饰试剂昂贵，本实验仅对6例福尔马林固定包埋组织中的DNA进行了修饰，并取得了良好的实验效果，为今后运用石蜡包埋标本进行分子生物学研究打下了良好的基础.有报道指出，从950mL/L乙醇固定石蜡包埋组织中提取的DNA较从福尔马林固定标本的DNA完整且含量很高.因本院外检标本基本都用福尔马林固定，遂未对950mL/L乙醇固定标本进行实验. 【参考文献】 1BaylinSB,HermanJG.DNAhypermethylationintumorigenesis:epigeticsjoinsgeneticsJ.TrendsGenet,2000,16(4):168-174. 2张维铭.现代分子生物学实验手册M.北京:科学出版社，2003:80-86. 3KeeSK,LeeJY,KimMJ,etal.HypermethylationoftheRasassociationdomainfamily1A(RASSF1A)geneingallbladdercancerJ.MolCell,2007,24(3):364-371. 4HermanJG,BaylinSB.GenesilencingincancerinassociationwithpromoterhypermethylationJ.NEnglJMed，2003,349:2042-2054. 5HuangQX,JinF,HuangHF.MethodologyofDNAmethylationJ.SectionGenetForeignMedSci,2004,27:354-358. 6ShiSR,CoteRJ,WuL,etal.DNAextractionfromarchivalformalinfixed,paraffinembeddedtissuesectionsbasedontheantigenretrievalprinciple:heatingundertheinfluenceofpHJ.JHistochemCytochem,2002,50:1005-1011. 7GillespieJW,BertCJ,BichselVE,etal.EvaluationofnonformalintissuefixationformolecularprofilingstudiesJ.AmJPathol,2002,160(2):449-457. 8LegrandB,MazancourtP,DurigonM,etal.DNAgenotypingofunbufferedformalinfixedparaffinembeddedtissuesJ.ForensicSciInt,2002,125:205-211. 9BielawskiK,ZaczekA,LisowskaU,etal.ThesuitabilityofDNAextractedfromformalinfixed,paraffinembeddedtissuesfordoubledifferentialpolymerasechainreactionanalysisJ.IntJMolMed,2001,8:573-578. 10LiLC.RajvirDahiyaMethprimer:designingprimersformethylationPCRsJ.Bio