细胞工程育种之花药离体培养.doc

细胞工程育种之花药离体培养季定根 植保1001一般是离体培养花粉处于单核时期（小孢子）的花药。通过培养使它离开正常的发育途径（即形成成熟花粉最后产生精子的途径）而分化成为单倍体植株，这是目前获得单倍体植株的主要方法。大体上要经过制备培养基、接种花药和培养三步骤。途径：由花粉长成单倍体一般有两条途径。一是由花粉脱分化形成愈伤组织（即分化程序很低的薄壁细胞团），再由愈伤组织再分化出根和芽，最后形成植株。二是由花粉分裂形成胚状体（不是由合子发育成的胚叫胚状体），再由胚状体长成植株。当瓶中花药内长出的小苗达到一定大小时，应调节温度、湿度及光照等条件，使幼苗得到锻炼并逐步适应自然的环境条件，然后从试管中移出种植于土壤中，进行一般的栽培和管理；或将形成的胚状体包裹人工种皮，制成人工种子。与单倍体育种差异：花药离体培养是一种组织培养技术，其过程是：把花粉发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上进行离体培养；花粉在培养基所提供的特定条件下可以发生多次分裂，形成类似胚胎的构造（胚状体）或愈伤组织；诱导愈伤组织分化出芽和根，最后长成植株。单倍体育种是一种育种方法，其过程是：在花药离体培养的基础上，用秋水仙素继续处理单倍体幼苗，使染色体数目加倍，重新恢复为二倍数。因为它们的二倍数染色体是由单倍数染色体本身加倍而来的，所以都是纯系，自交后代不会发生性状分离，因此在育种上有很高的应用价值。由此可知，花药离体培养与单倍体育种关系密切花药离体培养是单倍体育种的首要环节，但两者的步骤和结果是不同的。 花药离体培养得到的植株不一定是单倍体，其原因还得从花药的结构和培育过程谈起。花药是花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒。按染色体的倍性来看，前者为二倍体细胞，后者为单倍体细胞。在离体培养过程中，由于花药愈伤组织的多倍化、核融合、花药壁和花丝等二倍体体细胞参与愈伤组织的形成、愈伤组织染色体的变化等因素，导致培养中有非单倍体植株出现。那些起源于花药壁、药隔或花丝细胞的植株，其染色体倍数应与提供花药的植株一样，完全可能是二倍体。花药与花粉培养有较大差异。花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。花药离体馀秋水仙素是单倍体实验的两步骤。植物组织培养是将离体的植物器官或组织在一定条件下培养成胚状体或植株幼苗，所以花药离体培养属于植物组织培养。一般的组织培养是利用体细胞所以后代与亲代之间性状非常相似，在不考虑细胞质遗传的情况下几乎完全随亲本，是无性生殖，故可看作一种克隆技术。花药离体培养中由于培养材料是花药，其本质是培养精细胞（属于生殖细胞，雄配子）所以新的幼苗细胞核遗传物质是亲本的一半，可看作有性生殖中的特殊类型（单性生殖）。所以从技术上看两者有包含关系从生殖上看，要根据培养材料确定是有性生殖还是无性生殖。花药离体培养在育种中的重要应用价值：（1）通过对所获得的单倍体植株进行染色体加倍，便可获得纯合二倍体，可缩短育种所需年限。（2）利用单倍体及其细胞进行诱变育种，无论是发生显性还是隐性突变，均可在当代表现出来，便于鉴定和选择，然后将发生有利突变的个体进行染色体加倍，即可获得遗传性稳定的纯合植株，从而加速育种进程。（3）利用单倍体植株的组织、细胞或原生质体作为外源基因转化的受体，有利于外源基因的整合表达。花粉单倍体育种研究成果:玉米花药离体培养研究离体条件下小孢子的发育途径。 在离体条件下，由于改变了花粉原来的生活环境，花粉的正常发育途径受到抑制，由一次分裂形成的花粉粒不再像正常发育过程中那样由生殖核再分裂一次形成两个精子核，花粉萌发形成花粉管进行正常的受精。在玉米的花药和小孢子培养过程中，离体的小孢子沿着不同的途径进行发育，大体上可以概括如下：小孢子核不进行第一次不均等分裂，也不分化成一个营养核和一个生殖核。而是第一次分裂形成两个相同的核，并且都继续分裂，最后发育成多核结构。小孢子核进行第一次不均等分裂，并分化成一个较大的营养核和一个较小的生殖核。营养核开始进行对称的分裂，并发育成一个多核的胚状体。在花药培养过程中，这是一条最主要的途径等。营养核也能进行不对称的分裂，但这样形成的多核体没有细胞壁的形成，也没有进一步的发育。胚状体由生殖核发育而成。通过这种途径产生的多细胞胚状结构所含细胞较小，而且与由营养核发育而成的结构相比，其细胞核的染色更深。在离体的小孢子培养过程中，这是一条主要途径等。营养核和生殖核互相融合并形成一个大的小孢子，这个小孢子有一个较大的核，没有液泡。根据调查，在玉米花药培养过程中，大约89%被诱导的小孢子属于这种模式。但这种结构不再继续发育成多核体或多细胞体$营养核和生殖核都开始分裂，并且各自独立发育，最后形成含有两种不同类型细胞的胚状体，即含有核染色较浅的大细胞和核染色较深的小细胞。这种情况不经常发生。花药培养的一般程序当玉米尚处于孕穗期时，将未成熟的雄穗取下，一般需经过一段时期的冷处理。花药接种前预先用醋酸洋红溶液等染液压片镜检，以确定花粉发育时期，并找出花粉时期与幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系。将小孢子发育单核中晚期和双核早期的花药取下，放入诱导培养基。约二十一至二十八天后，可观察到胚状体。胚状体转入再生培养基，产生小植株。经过染色体加倍，产生双单倍体。然后经自交产生双单倍体种子。此外，还有另一条途径，即用胚状体来诱导可再生的愈伤组织。培养基一般要含较高浓度的脯氨酸。把愈伤组织转移到再生培养基上便可产生再生植株，与经胚状体直接再生的相同。这种途径的优点有：同一块愈伤组织可产生几棵植株，如果自交不能进行，可以采用近亲授粉。染色体加倍方便。但由于增加了愈伤组织阶段，使离体培养时间加长，就增加了遗传