植物细胞工程技术原理.ppt

第四章 植物细胞工程技术原理,主要内容,实验室设计及无菌技术 培养基及其配制 外植体的选取及接种培养,一、培养基及其配制,培养基的组成成分 培养基的分类 培养基的配制,1、培养基的组成成分,最早 风眼兰 栅栏组织 Knop溶液+蔗糖 存活不分裂 1934年 White 番茄根离体培养成功（1937年发现B族维生素的作用，创立White培养基） 1948年 Skoog和崔真 烟草茎段培养 发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用 培养基的组成：水、无机盐、糖、有机物、植物激素、其他添加物等。,1、培养基的组成成分,糖：碳源，维持培养基的渗透压 3%（26%） 无机盐：一般有1020种，分为大量元素和微量元素两类。 大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg 微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo 一种离子一般由一种以上的无机盐提供，以保证离子平衡，避免由于培养物吸收差异引起的pH变动。,1、培养基的组成成分,有机物：维生素类 Vit B1（硫胺素） Vit B6（盐酸吡哆醇） Vit B3（烟酸） Vit B5（泛酸钙） 肌醇 氨基酸 CH（水解酪蛋白）、LH（水解乳蛋白） ME（麦芽提取物）、YE（酵母浸出物）,1、培养基的组成成分,植物激素： 生长素类：诱导细胞的分裂和根的分化； IBA、IAA、NAA、2,4-D 0.1mol/L的NaOH配制 细胞分裂素类：促进细胞分裂和分化不定芽 6-BA、KT、ZA、2iP 0.5或1mol/L的HCl配制,1、培养基的组成成分,其他添加成分： 固化剂（gelling agent）：琼脂 用量一般为7-10g/L，即0.7-1%（W/V） 太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固。 吸附剂：活性碳，适用于培养中容易形成不利于生长的分泌物的培养物。,pH 变动,高中化学：无机盐溶液酸碱性的判断依据是，该盐是否发生水解。强酸强碱盐如NaCl中性；强酸弱碱盐如NH4Cl酸性；强碱弱酸盐如Na2CO3碱性。 大学：植物对矿质元素的吸收是以离子形式进行的，以交换吸附方式发生，阳离子和H+发生交换吸附；阴离子和HCO3- 13种必需矿质元素的吸收量存在如下关系： 大量元素：NKCaMg=PS；微量元素：Cl=FeMnBZnCu=Mo (NH4)2SO4中，吸收量NS，培养基中H+多，生理酸性盐，pH减小 KNO3中， NK，HCO3-多，生理碱性盐，pH增大。,2、培养基的分类,按性质分： 基本培养基 完全培养基：基本培养基加激素 按状态分 固体培养基 液体培养基,2、培养基的分类,基本培养基按照组成成分又可分为很多种，常见的如MS、Miller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。根据其盐浓度大致可分为四类： 富盐平衡培养基： MS 高硝态氮培养基： B5、N6 中盐培养基： Miller，大量元素浓度为MS的一半 低盐培养基：White，生根培养,3、培养基的选择,查阅文献资料，参考已有研究结果 选择基本培养基 确定激素种类和浓度（配方） 自己实验,4、培养基的配制,（1）、母液配制： 母液：实际是一种贮存液，比实际使用溶液浓度高。方便，准确。 以KNO3为例：1L培养基需要量为19g，在配制母液时，增加为10倍量即190g，这样用母液配制培养基时，只要1/10的母液量就可以了。,4、培养基的配制,（1）、母液配制： 一般把母液分成大量元素、微量元素、有机物等几类进行配制。 大量元素配制成10-20 的母液 微量元素配制成100-200 的母液 有机一般配制成100 的母液 激素单独配制成1mg/ml的母液,4、培养基的配制,2、培养基的配制 称取适量的糖（固体培养基还需要琼脂），溶解 根据要配制的培养基体积按比例加入所需体积的母液（如有琼脂则需煮沸至澄清） 加入激素，定容（热不稳定激素需灭菌后加入） 调节pH值为5.86.0（这一步一定要最后操作）,二、外植体的选取及接种培养,1、外植体（explant）的选取 外植体：是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料 。 用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源： 一是生长在自然环境下的植物； 二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物； 三是无菌环境下已经过离体培养的植物。,二、外植体的选取及接种培养,1、外植体（explant）的选取 根据培养需求选择植物部位 多年生植物注意树龄和季节 在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体,2、外 植 体 灭 菌,1、常用消毒剂及特点,2、外 植 体 灭 菌,消毒剂的筛选设计？,2、外 植 体 灭 菌,灭菌程序及筛选,准备室,超净台上,70%酒精 1min NaClO/HgCl2,洗45次,3、接种,用解剖刀、镊子将外植体分割成适当大小 于酒精灯