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酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用摘要: 酶联免疫吸附是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析技术。文中主要从农药残留、兽药残留、违禁药物、转基因食品、病原微生物、生物毒素以及其他成分等几方面, 对该技术在食品安全检测中的应用进行了综述, 并提出了存在的问题以及展望。关键词: 酶联免疫吸附技术; 食品安全检测; 应用Application of ELISA technology on food safety detectionAbstract: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay is an immunoassay technology established on the highly specific-antibody reaction and efficient catalysis is of enzyme. In this paper,the application of ELISA on food safety detection is reviewed, including pesticide residue,animal drug residue,forbidden drugs,genetically modified foods,pathogenic microorganisms,biotoxin and others,and the existed problems and corresponding methods to solution are proposed.Key word: enzyme-linked immunosorbent assay;food safety detection;application 食品安全问题是全球关注的焦点,它直接影响人类健康和经济发展,几年前的苏丹红事件、啤酒甲醛风波、人造蜂蜜事件、乃至今年的三鹿奶粉事件都给人们敲响了食品安全的警钟。如何快速、有效检测食品中的污染物残留,保证食品的安全供应是食品检验中的一个重点。酶联免疫吸附技术(ELISA)是在免疫荧光和放射免疫分析技术基础上形成的,将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合的一种免疫分析方法1。该方法操作简便、快速、有效、特异性强,能广泛用于临床标本、药物残留、转基因食品以及病原微生物检测等多个领域。本文主要概述了酶联免疫吸附法在食品安全检测中的研究及应用前景。 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA)是一种固相酶免疫分析方法。它始于1971年En-gvall用碱性磷酸酯酶标记的免疫球蛋白测定IgG,随后这种方法得到迅速发展和不断完善。由于ELISA结合了免疫荧光法和放射免疫法两种技术的优点,具有选择性好、灵敏度高、结果判断客观准确、检测速度快、实用性强等特点,因而弥补了经典化学法和其他仪器法的不足,目前已广泛应用于临床医学和生物学等领域,在食品领域中应用相对较少,但随着食品安全问题日益受到社会各界的关注,它在食品安全分析中的研究和应用越来越多。为此本文就ELISA在食品安全分析中的应用作以如下评述,旨在促进该技术在食品安全分析领域中的发展。1 酶联免疫吸附法概述1. 1原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性2。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析3。1.2ELISA分类ELISA方法的分类至今还没有一个统一的标准,最常用的测定方法有三类:(1) 间接法测定抗原:(2)双抗体夹心法测抗原:(3)竞争法测抗原1.3 与其他检测法相比的优势 目前用于食品安全检测的方法有很多，如薄层色谱(TLC)、微生物法、气相色谱(GC)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)、和核酸探针技术等。TLC 必须进行较为复杂的样品预处理和抽提，且不能定量，灵敏度低。微生物法不易筛选到特别敏感的菌株，也只能定性不能定量，易受其他抗菌药物的影响。GC 及 H P L C等虽灵敏度高，但设备昂贵，样品预处理复杂，检测费用高，难以推广使4，核酸探针则在实验过程中易受到污染。相比之下，ELISA 不仅灵敏度高、干扰小、安全性高、污染少，而且操作简便快捷5，这些优点使其可在蔬菜产区、蔬菜批发市场和海关配备，工作人员可随身携带或建立固定的食品安全速测点，随时把残毒超标的蔬菜、水果杜绝在食用或海关出口之前。2 ELISA 在食品安全检测中的应用2.1 食品中农药残留的测定 农药残留是指农药使用后残存于食品原料与半成品食品及成品中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物以及杂质的总称。目前, 农药残留已成为食品中的主要安全问题之一, 也直接影响了我国农副产品出口6。 农药属于小分子物质, 是一种半抗原, 无免疫原性。检测时首先要根据农药的结构选择合成路线,人工合成抗原, 然后免疫 BALB/c 小鼠, 利用杂交瘤技 术 则 可 制 备 出 针 对 农 药 小 分 子 的 McAb。 由 于McAb 可以大量产生, 质地均匀, 适于标准化管理且容易制备试剂盒。 常用的 ELISA 检测的农药残留种类有: 有机磷农药: 有报道7采用 ELISA 法检测对乙酰甲胺磷。拟除虫菊酯类农药: 骆爱兰等8以菊酯类农药的通用结构间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原, 与牛血清蛋白(BSA)结合制备多种菊酯类农药有特异性的广谱性抗体, 建立间接竞争 ELISA 检测方法, 对 PBA 最低检出限达 0.193 g/mL, 抑制中浓度为 3.707 g/mL,且对氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴 氰 菊 酯 均 有 特 异 性 识 别 。有 机 氯 类 农 药9:Deschamps 等用毒莠定与 BSA 结合免疫兔和小鼠,分别制备多克隆抗体和 McAb, 比较两者的灵敏度和特异性, 兔抗血清的线性范围为 5-5000 ng/mL, 最低检出限为 5 ng/mL, 小鼠 McAb 的线性范围为 1-20 ng/mL, 最低检出限为 1 ng/mL。2.2 食品中兽药残留和违禁药物的测定 食品中兽药残留主要包括抗生素类、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫类、激素药类和驱虫药类药物。ELISA 操作简便、灵敏, 可使得痕量的药物残留分析成为普通实验室的常规技术, 而且可同时检测数十个甚至上百个样品, 是十分理想的大批量样品中药物残留的快速筛选手段。目前可供选择的商品化的ELISA专用试剂盒、酶标仪很多, 技术已相当成熟10。瘦肉精是一种被各国禁止作为生长促进剂使用的人工合成物质, 化学名为盐酸克伦特罗, 是一种2- 肾上激素受体激动剂。化学性质稳定, 加热到170 才能分解, 因此, 一般的烹调加热方法不能将猪肉和脏器中残留的 “瘦肉精”毒性破坏。一旦人食用了含瘦肉精的肉, 会导致头痛、头晕、心悸、四肢麻木等一系列不良反应, 同时会在人体内蓄积, 可能最终产生致畸、致癌、致突变作用11。目前国内外已 研 制 出 同 类 多 种 试 剂 盒 用 于 检 测 ,其大都采用竞争 ELISA 法, 应用于瘦肉精检测灵敏度高, 成本低, 前处理简单且快速, 适用于现场定性快速检测及快速筛选检验12。己烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)为人工合成的二苯乙烯类雌激素药, 具有很强的副作用, 能够破坏机体遗传物质, 最终导致基因突变而引发机体肿瘤。邴爱英等13利用亲和素与生物素之间亲和力极强, 且具有高度特异性和稳定性的原理, 研究建立双抗体夹心 ELISA 法。用人工合成的己烯雌酚免疫原多次免疫家兔, 获取高效价抗体。纯化抗体经生物素标记, 可同辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素特异结合。采用纯化的抗体包被 96 孔板, 形成固相抗体。加入不同浓度的己烯雌酚标准品后, 再加入生物素标记抗体, 以酶标记亲和素作为探针, 经酶底物显色反应可获得良好的 ELISA 标准曲线。该测定方法最低检测限为 0.125 ng/mL, 可定量检测范围为 0.2515.60 ng/mL, 但农业部 动物性食品中兽药最高残留限量中规定, DES 在所有食品动物可食组织中的残留限量为不得检出, 因此该方法检测灵敏度仍然较低, 需进一步改进方法, 降低检测限。ELISA 法还可检测动物性食品中的四环素类抗生素残留量, 精密度和灵敏度高, 且检测速度快等特点, 适合进行快速检测14。2.3 转基因食品的检测 转基因食品的安全性是最近有关食品安全性研讨的热点。由于其安全性还在争议之中, 许多国家都有严格的法规来管理转基因食品。其中有一条规定就是要求在转基因食品包装上贴上标签, 让消费者有知情权。这就需要对转基 因食品进行检测。ELISA 法就是通过检测某些特定的转基因表达蛋白,以分析食品是否来自转基因生物或者含有转基因成分, 或间接检测转基因表达的目的蛋白质15。2.4 食品中病原微生物的检测 病原微生物是食品生物性污染的重要因素。常规的微生物学检验通常以分离培养、生化试验及血清学试验来进行判断, 不仅需要大量的手工劳动,而且检验周期长(6-7 d)16。同时有些细菌, 如副溶血性弧菌、幽门螺杆菌、大肠杆菌等在低温贫营养的条件下, 可以进入 “活的非可培养状态”, 在适当状态下还可以复苏, 仍具有致病力。因此常规的培养法无法检测到处于这种状态的细菌容易造成漏检。而ELISA 在这方面具有一定的潜力。ELISA 法可用于检测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、军团菌、大肠杆菌 O- 157 等致病微生物。其中沙门氏菌是食物细菌性中毒中最常见的致病菌,它严重影响着食品安全。传统的检测法试剂繁杂、检测周期长, 不能适应实际需要, 而采用制备单克隆抗体的 ELISA 方法则能方便、快速地筛选出被沙门氏菌污染的食品或饲料17。其基本步骤是首先包被抗沙门氏菌的单克隆抗体, 然后在微孔板内加入经过前增菌和选择性增菌的待检样品, 样品中如有沙门氏菌存在, 则与微孔板内的特异性抗体结合形成复合物。洗涤掉多余的反应物, 加入酶标抗体,则形成抗体抗原酶标抗体复合物。加入底物, 测定光密度, 当光密度值大于或等于临界值时, 即可推断为阳性。2.5 食品中生物毒素的检测 生物毒素是其产生菌在适合产毒的条件下所产生的次生代谢产物。在食品加工时虽然经加热、烹调等热处理, 但所产生的毒素结构一般不能被破坏,所以食品中生物毒素也日益受到关注18。黄曲霉毒素是一种致毒性和致癌性很强的真菌毒素, 各国都严格限制其在食品中的含量。1977 年, La Well 首次采用了 ELISA 法来检测黄曲霉毒素。蒋建云等利用ELISA 法的 AFB1 试剂盒, 通过抗黄曲霉毒素 B1 抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测黄曲霉毒素 B1 的含量。具有分析速度快, 提取和纯化步骤简便, 准确度高、成本低、污染少, 一次可测定大批量等优点19。2.6 食品中其他成分的检测2.6.1 过敏性残留物的检测 食物过敏反应已成为世界各地普遍存在的一个严重问题, 引起了人们的广泛关注。FAO(1995)报告的 8 类过敏食物分别是牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、蟹、龙虾)、花生、大豆、核果类(杏、板栗、腰果等)及小麦。它们中的大多数过性成分是蛋白质。目前已建立的夹心 ELISA 法,用来检测花生蛋白过敏物、- 乳球蛋白过敏物、榛实成分以及鸡蛋过敏性蛋白质20。2.6.2 功能因子的检测 功能因子主要包括活性多糖、多不饱和脂肪酸、肽与蛋白质、醇类、卵磷脂、乳酸菌、矿物质、膳食纤维等。其通过激活酶的活性或其他途径, 调节人体机能, 特殊功效主要集中在调节血脂、血糖、免疫调节、延缓衰老、改善睡眠、促进生长发育、耐缺氧、改善骨质疏松、改善视力等方面21。2.6.3 毒品、生物碱的检测 目前, 已建立了针对海洛因、可卡因、吗啡等毒品的 ELISA 检测方法。在食品卫生方面, 有些店家在食品中(尤其是火锅、汤料等)添加罂粟壳(粉), 以招引顾客22。江苏省微生物研究所针对罂粟壳中的罂粟碱已建立了 ELISA 检测法,利用商品化的试剂盒检测更为方便快捷。3 ELISA 存在的问题ELISA 因具特异性强、灵敏度高、快速、价廉和不需烦琐的预处理等优点, 已成为现场分析的首选方法23。但其应用于食品安全检测方面也存在着如下的一些问题: 制备抗体较困难; 对试剂的选择性高; 不能同时分析多种成分; 对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应; 分析低分子量或不稳定的化合物有一定的困难; 灵敏度偏低以及难于标准化等24。如应用于农药残留检测时, 抗农药抗体对于结构非相关的靶抗原(农药)表现极高的特异性, 但某些与检测农药结构密切相关的农药, 或待检农药的代谢产物可能与抗待检农药抗体发生不同程度的交叉反应。如果样品中存在这些物质, 将导致定量检测准确度降低, 使该农药的定量检测降为半定量或定性检测或者出现定性假阳性与假阴性,从而大大影响 ELISA 的可靠性和灵敏度25。 4 展望 ELISA 与其他技术相比, 具有灵敏度高, 特异性强, 仪器设备要求不高, 测定成本低, 方法快速、简便, 试剂保存时间较长, 自动化程度高, 无放射性同位素污染等优势; 但同时也存在局限性, 比如不能同时分析多种成分, 对试剂的选择性高, 对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应26。所以未来的发展趋势就在于开发高度免疫原性的重组抗原, 研究多项标记快速测定方法, 将酶体外定向进化应用到检测中以及研发种类更多的全自动酶联免疫测定仪。这样将扩大检测的范围, 提高检测的稳定性, 加强标准化, 同时也促进了商品化的应用27。另外, 还应与其他检测技术如色谱、PCR 等结合起来, 实现强强联合, 优势互补。在未来食品安全的快速检测中发挥更加突出和重要的作用。参考文献:1 唐英章.现代食品安全检测技术M.北京:科学出版社,2004:364,380-381.2 周宏琛.动物源性食品安全快速检测及酶联免疫吸附方法的应用J.肉类研究,2006,(3):29- 32.3 朱慧莉,黎锡流,许喜林.酶联免疫吸附法及其在食品分析中的应用J.食品工业科技,2001,22(2):80-82.4 李玉珍,林亲录,肖怀秋.酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用研究进展J.中国食品添加剂,2006,(3):108- 112.5 王向红,崔小军,李昕,等.食品中有机磷农药检测方法研究进展J.食品研究与开发,2006,11(27):193.6 Antonio abad. 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