真核细胞表达系统(自动保存).docx

4000字。技术方法类（包括分析方法类）释文提纲：（1）定义及概述（不设标题）（2）技术或方法原理（及发展历史）（3）应用及注意事项意见：基本符合百科全书的要求。真核细胞表达系统 （Eukaryotic expression system）运用基因工程技术手段，在体外将外源基因分子插入病毒、质粒等载体分子，形成新的遗传物质组合，并导入真核细胞中实现外源基因蛋白表达的技术系统。按照宿主细胞类型，真核细胞表达系统包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。真核细胞表达系统是重组蛋白表达的有利工具，在基础科学及医药领域发挥了重要作用。技术或方法原理（及发展历史）酵母表达系统 酵母是低等的单细胞真核模式生物，已完成基因组测序，遗传背景清晰，具有生长繁殖快，成本低，易于实现高密度培养和大规模发酵的优点。目前发展成熟的酵母表达系统主要包括酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。酿酒酵母在食品工业领域的使用已有数千年历史，被美国FDA确认为安全性生物。1981年，Hitzeman等将成功将人干扰素基因导入酿酒酵母细胞，揭开了酿酒酵母表达系统的研究和应用历史，迄今已有多种外源蛋白在酿酒酵母中获得表达。然而酿酒酵母表达系统存在缺乏强启动子，质粒易丢失，分泌效率低，且富含高甘露糖型超糖基化等不足，导致表达产物存在过度糖基化的局限性，而逐渐被巴斯德毕赤酵母等甲醇营养型酵母表达系统所取代。巴斯德毕赤酵母来源于野生型石油酵母NRRL-Y11430，为子囊菌类单倍体酵母，富含甲醇代谢必须的醇氧化酶、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶的过氧化物酶系，能在以甲醇为唯一碳源的简单培养基上快速生长，属于甲醇营养型酵母的一种。基因工程常用的毕赤酵母菌株主要包括GS115（Mut+His）、X-33（Mut+His+）、KM71（Muts His）、SMD1168（his4 pep4）等。目前毕赤酵母表达系统的启动子有醇氧化酶AOX1启动子(Ellis et al., 1985)及三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子，外源基因通过同源重组整合到酵母染色体基因组上,外源蛋白表达水平受甲醇或葡萄糖的严格调控。表达产物有胞内表达和胞外分泌两种方式，胞内表达适合于通常在胞浆中表达或不含二硫键的非糖基化蛋白，胞内表达载体有 pPIC3、pPSC3k、pHIL-D1、pAO815 等5。分泌型表达载体在酵母因子信号肽的引导下，将成熟的蛋白质分泌到细胞外，分泌型表达载体有pPIC9K、pHIL-S1p、YAM7SP6、pGAPZa、pPICZ 等。毕赤酵母表达系统具有操作简便、遗传稳定、表达量高、对目的蛋白质进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰功能，使表达的重组蛋白具有同天然蛋白相似的生物学功能，在非糖活性蛋白生产上具有显著优势。昆虫细胞表达系统 昆虫细胞具有与高等真核生物细胞相似的翻译后修饰、加工及转移蛋白质的能力。昆虫细胞表达系统主要利昆虫细胞、昆虫整体和杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等, 使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白; 其最高表达量可达500mg/L;可表达非常大的外源性基因(- 200kD); 具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力; 对脊椎动物安全。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高, 至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。昆虫杆状病毒表达载体系统是一个利用杆状病毒作为外源基因的载体通过感染昆虫细胞或者昆虫幼虫来表达外源蛋白的系统。该系统自上世纪八十年代开发成功以来，在过去的二十年里得到了迅速的发展，已被证明为高效的真核表达系统之一1，目前在重组蛋白表达生产、工程疫苗和蛋白质组学研究等领域得到了越来越多的应用。昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统,它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式,其表达的蛋白水平高达1500mgPL,但受到诸多因素的限制和影响,如培养基质量、供氧情况、保证对数生长等;此系统的主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下,而这时由于病毒感染,细胞开始死亡。解决办法是适当的启动子调控下的基因稳定转化。另一类新型的昆虫表达系统是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础上的,在稳定和表达效率方面有更为突出的优点。利用转座子转化昆虫细胞,目前已借助herm、hobo、mariger、piggyBac等转座子完成了对果蝇、伊蚊等双翅目昆虫细胞的稳定转化,然而其对鳞翅目昆虫却没有效果14。此系统可用于大量制备有功能活性的目的蛋白,其表达水平高于哺乳动物表达系统,并且在表达真核蛋白时,可以进行翻译后修饰,其优越性远远超过细菌表达系统。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。主要利昆虫细胞、昆虫整体和杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体, 可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能, 如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等, 使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白; 其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的 50%; 可表达非常大的外源性基因(- 200kD); 具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力; 对脊椎动物安全。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高, 至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。邓宁(1996) 报道, 杆状病毒是最大的环状 DNA 病毒,其基因组在 90230kb 之间, 具有编码上百种蛋白质的能力。杆状病毒不仅是研究细胞分子生物学的重要工具, 也是许多真核和原核基因在昆虫细胞中表达的中间载体。杆状病毒转染的昆虫细胞表达系统, 表达重组蛋白量可高达 5000mg/L; 具有与哺乳动物系统相同的翻译后修饰过程, 因而产生的重组蛋白与哺乳动物蛋白的抗原性、免疫性、功能基本一致; 易于鉴定纯化重组病毒及重组蛋白产物, 使该系统成为一个有效的真核表达系统。昆虫表达系统建立于 1983 年，利用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体杆状病毒(Baculoviridae)作为外源基因的表达载体转染昆虫草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的一个细胞系，用于人-干扰素的生产(Rai and Padh, 2001)。此后，由于杆状病毒具有启动子序列在哺乳动物细胞内没有活性、对脊椎动物无传染性(这对于表达肿瘤相关基因以及有潜在毒性的蛋白是很有利的)、能同时克隆多个外源基因、悬浮培养的昆虫细胞可增殖到很高的滴度、多数表达的蛋白在昆虫体内能保持可溶状态、重组体杆状病毒在自然界生存短暂从而可以保证生物安全等优点，使该系统发展迅速，建立了当今比较流行的重组杆状病毒表达系统和昆虫细胞稳定转化表达系统，在重组蛋白表达生产、工程疫苗和蛋白质组学研究等领域得到越来越多的应用。在表达更多目基因包括致癌基因方面较上述两个系统略胜一筹(Mahmoud, 2007)。重组杆状病毒表达系统中最常用的载体是多核多角体病毒(Multiple nuclear polyhedrosis virus)，其原型是苜蓿银纹夜蛾多(核壳体)核型多角体病毒(Autographica californica MNPV, AcMNPV)。能在受感染的细胞内形成大量的多角体蛋白衍生蛋白，约占宿主细胞总蛋白的 30%50%。但它并不是必需蛋白，因此可以用外源蛋白的开放读码框(ORF)替代多角体蛋白 ORF 来构建表达载体。但是，杆状病毒分子量大(80200 kb)，不能象质粒载体那样利用多克隆位点进行基因重组，只能利用杆状病毒和带有目的基因序列的质粒载体进行共转染，借助携带目的基因的质粒载体中人为引入的杆状病毒多角体蛋白两翼序列的同源序列，利用昆虫宿主细胞的相关酶系和蛋白质因子，通过同源重组实现目的基因对病毒多角体蛋白基因的取代。但是，以野生型杆状病毒DNA进行共转染时重组频率极低,只有 0.1%，利用线形化的病毒载体可将重组率提高到 30%。目前，已经构建了多种各有特色的杆状病毒载体以及昆虫细胞系如sf9、sf21、s2、HighFiveTM、expressSF+誖细胞系等.国内已有相关综述(尹长城等, 2001)。另外一种昆虫细胞表达系统是基于对宿主细胞基因组进行稳定转化的昆虫细胞核基因转化表达系统。寄主细胞主要来自双翅目昆虫，通常是果蝇和蚊子，如来自果蝇的 Schneider2 和 Kc 细胞系以及来自白纹伊蚊(Aedes albopictus)的 C7 细胞系等。2007 年，第一个由昆虫细胞生产的抗人乳头淋瘤病毒疫苗在英国葛兰素史克(GlaxoSmit