环境仪器分析第七章高效液相色谱法.ppt

第七章 高效液相色谱法,High Pressure Liquid Chromatography,第一节 概述,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱的特点 四、高效液相色谱的局限性,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测 2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：在操作温度下能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、不易挥发、热稳定性差及高聚物和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的7080%,续前,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,续前,三、HPLC的特点,“三高” “一快” “一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,四、高效液相色谱的应用方位和局限性,1、应用范围 高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、相对分子质量大的、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等，包括石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%有机化合物，包括永久性气体、易挥发低沸点及中等相对分子质量的化合物，只能用气相色谱法。,2、局限性 1）使用多种流动相 成本高于GC，且易引起环境污染 梯度洗脱比气象中的程序升温操作复杂 2）缺少通用检测器 3）不能完成组成复杂具有多种沸程的石油产品的分析（毛细管气象色谱法分析） 4）也不能替代中低压色谱法,第二节 高效液相色谱的分离原理与分类,一、液相色谱分离原理 固定相：吸附剂、化学键和固定相、离子交换树脂或多孔凝胶 流动相：各种溶剂 被分离的混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（溶质）与溶剂（流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力大小决定色谱过程的保留行为。,不同组分在两相间的吸附、分配、离子交换、亲和力或分子尺寸等性质存在微小差别，经过连续多次在两相间的质量交换，这种性质微小差别被叠加、放大，最终得到分离。 不同组分性质上的微小差别是色谱分离的根本-必要条件 在两相间进行了上千次甚至上百万次的质量交换，是色谱分离的充分条件,二、高效液相色谱的分类 1. 液固色谱（LSC） 通常也称吸附色谱法。 分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同。依靠流动相溶剂分子与溶剂分子竞争固定相活性位置，从而是溶质从色谱柱上洗脱下来。 与硅胶表面活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强，称强溶剂。 常用吸附剂：硅胶或氧化铝，510um 适用于相对分子质量2001000的组分 大多数属于非离子型化合物,续前,2固定相：与LC比，固定相粒径不同（10m）,（2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物,续前,3流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -,4影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性，洗脱能力，k，tR 溶剂系统极性，洗脱能力，k， tR 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 5出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱 对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性 对同系物（即分子量大小）的选择性分离弱。 常用于分离同分异构体，可用于脂溶性化合物的分析，如磷脂、甾体化合物、脂溶性维生素,2. 液液色谱法（LLC） 其流动相和固定相都是液体，固定相是通过化学键合的方式固定在基质（惰性载体）上的。 分离原理：根据各组分在固定相与流动相中的相对溶解度（分配系数）的差异进行分离，分离过程是一个分配平衡过程。 理论上说，流动相与固定相之间应互不相溶,据所用固定液与流动相液体极性的差异，液-液分配色谱可分为正相色谱和反相色谱。 正相色谱：固定相的极性流动相的极性 洗脱顺序:按组分极性从小到大流出。 流动相溶剂：非极性疏水性溶剂，如庚烷、己烷及异辛烷。 极性大的溶剂是强溶剂 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等调节组分的保留时间 常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基累计氨基酸类等） 根据化合物在固定相及流动相中分配系数的不同进行分离，不适合于分离几何异构体,反相色谱：固定相的极性小于流动相极性。组分的洗脱顺序和正相色谱相反，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 固定相：共价结合到载体上的一些直链碳氢化合物，如正辛烷。 疏水性强的化合物在色谱柱中滞留时间长 反相色谱法中不同的化合物因各自的疏水特性得到分离。 适于分离带有不同疏水基团（非极性基团）的化合物、带有不同极性基团的化合物 反相色谱中，水在流动相中所占比例可调，所以可用于水溶性、脂溶性化合物的分离,液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物，极性的或非极性的、有机物或无机物、大分于或小分于物质的分离，只要官能团不同、或者官能团数目不同、或者是分子量不同均可获得满意的分离。,离子交换色谱法 固定相:带电荷的基团 常用苯乙烯和二乙烯苯交联形成的聚合物为骨架 在表面末端芳环上接上羧基、磺酸基为阳离子交换树脂，接上季胺基为阴离子交换树脂。 按质量作用定律，树脂上可电离的离子与流动性中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行交换，各离子与离子交换基团之间因具有不同的电荷吸引力而分离。 主要用于可电离化合物的分离，如多肽、蛋白质、核苷酸、核苷和各种碱基的分离等,4. 离子对色谱 又称偶离子色谱法。 是在流动相中加入具有与被测离子相反电荷的离子，即“离子对试剂”，使之与被测离子形成中性离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留。保留的强弱主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度 主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠，辛烷磺酸钠 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵，四丁基磷酸盐,空间排阻色谱法（凝胶色谱法） 固定相：有一定孔径的多孔性填料 流动相：可以溶解样品的溶剂 相对分子量小的化合物可以进入孔中，滞留时间长；相对分子质量大的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。 利用分子筛对相对分子量大小不同的个组分排阻能力的差异完成分离。 缺点：不能分辨分子大小相近的化合物 常用于分离高分子化合物，如多肽、蛋白质、核酸等,排阻色谱分离过程模型,空间排阻色谱分离示意图,6.高效液相色谱分离类型的选择 高效液相色谱每种分离类型都有其自身的特点和适用范围，没有一种类型可以通用于所有领域，它们互相补充。一般情况，选择最有效的分离类型，应考虑样品来源，样品的性质（相对分子质量、化学结构、极性、化学稳定性、溶解度参数等化学性质和物理性质），分析目的要求，液相色谱分离类型的特点及应用范围、实验室条件（仪器、色谱柱等）等一系列因素。,液相色谱分离类型选择参考表,第三节 基本理论和条件选择,一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择,一、塔板理论,二、速率理论（与GC对比）,1.,续前,2）涡流扩散项及其影响 next,2.,讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）,图示,续前,3）传质阻抗项及其影响,图示,高效液相色谱仪由以下五部分组成： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统（记录仪、积分仪和色谱工作站）,第四节 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪流程图,高效液相色谱仪的工作过程： 输液泵将流动相一稳定的流速或压力输送到分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品倒入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理或保存。,1高压输液系统：溶剂储存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等。 泵：按输出液恒定的因素分 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用 对泵的要求： 无脉动 流速恒定 流量可调 耐腐蚀 便于实现程序控制 死体积小，便于测压、调整及维护。,2进样装置 包括进样口、注射器和进样阀等，作用是把分析试样有效的送入色谱柱上进行分离。 1）隔膜进样-微量注射器 （高分子有机硅胶垫进样室） GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期） 隔膜容易吸附样品产生记忆效应 2）阀进样：不必停泵，六通阀,3色谱柱： 柱内径25mm,柱长1030cm 装柱方法：干法和湿法两种 填料粒度大于20 m的可用干法装柱；粒度小于 20 m的填料不宜用干法装柱，这是由于微小颗粒表面存在着局部电荷，具有很高的表面能，因此在干燥时倾向于颗粒间的相互聚集，产生宽的颗粒范围并粘附于管壁，这些都不利于获得高的柱效。目前，对微颗粒填料的装柱只能采用湿法完成。 湿法也称匀浆法，即以一合适的溶剂或混合溶剂作为分散介质，使填料微粒在介质中高度分散，形成匀浆，然后，用加压介质在高压下将勾桨压入柱管中，以制成具有均匀、紧密填充床的高效柱。 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗,4检测器 1）紫外检测器 ultraviolet-visible detector, UVD 高效液相色谱仪中应用最广泛的一种。是一种灵敏度和检测精度都较高的选择性浓度型检测器。 适用于在紫外可见区有吸收的样品。 作用原理：基于被分析样品组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比耳(Beer)定律。,紫外可见检测器的优缺点 优点; (1)灵敏度高，最小检测浓度可达10-8 gmL-1； (2) 选择性好，对柱温控制精度要求不高，对流动相流速变化不敏感，适用梯度洗脱，对样品无破坏性、线性范围宽。 缺点 (1)是对压力变化敏感，要求用无脉冲泵； (2) 对在紫外可见光区无强吸收的组分，需要经过衍生化，才可用紫外可见检测器，如糖类、氨基酸、类酯化物等； (3)不能用在紫外可见光区有吸收的溶剂作流动相。,2）示差折光检测器 refractive index detector, RID 浓度型通用检测器。 利用折光率的差别，根据流动相中出现组 分时，流动相折射率发生变化而设计的。 优点：对所有的物质都有响应 ； 灵敏度可达到10-7 gmL-1 缺点： 对温度变化很敏感； 不能用于梯度洗提脱。,3）电化学检测器：electrochemical detector, ED 根据电化学分析方法设计的。 电化学检测器主要有两种类型： 一是根据溶液的导电性质，通过测定离子溶液电导率的大小来测量离子浓度； 另一类是根据化合物在电解池中工作电极上所发生的氧化-还原反应，通过电位、电流和电量的测量，确定化合物在溶液中的浓度。 电导检测器是根据被测组分被淋洗下来后，流动相电导率发生变化的原理而设计的。它仅适用于水溶性流动相中离子型化合物的检测，也是一种选择性检测器。 缺点是灵敏度不高，对温度敏感，需配以好的温控系统，且不适于梯度淋洗。,4）荧光检测器（F1uorescence Detector，FD） 基于物质经紫外光照射后，发射出较原激发光波长长的二次（荧）光。在一定条件下荧光的强度与溶液中产生荧光物质的浓度成正比。 荧光检测器为选择性检测器。 有两种类型的化合物可用其检测： (1) 它们自身发射荧光; (2) 通过衍生的方法使原来不发射荧光的化合物发射荧光. 很多生物活性物质、药物制品、环境污染物自身都能发射荧光。 荧光检测器由于具有很高的灵敏度和选择性，因而成为液相色谱常用检测器之一。但其适用范围窄，应用有一定局限性。,第五节 影响分离的因素,1,续前,2对流动相的要求：,1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的 3）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学 4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气,续前,3洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）,图示,第六节 高效液相色谱法 在环境中的应用,1903年自Tswett开创色谱法以来，Tames和Martin、Kirkland和Small相继报道了气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）和离子色谱法（IC）。在已知大约存在300万种以上的化合物中，适于GC有效地进行分析的挥发性、热稳定的化合物占20%左右，而HPLC可分析挥发性低、易受热分解、离子型或大分子（分子量大于300以上）的化合物约占80%左右。 离子色谱法可同时测定多种阴离子、阳离子和有机阴离子,优于电化学法和原子吸收法。色谱法在环境监测分析中已占有主导地位。,高效液相色谱法是吸取了气相色谱和经典液相色谱的优点，用现代化的手段加以改进，已得到广泛应用,特别适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。如多环芳烃类、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药、除草剂等。,环境样品，无论是水质、大气、土壤或生物物质，大都具有成分复杂、分析对象多、含量低等特点，某些本底值甚至只有ppt级；样品性质一般不够稳定，需要快速连续测定。 HPLC具有高效、快速、灵敏度高、选择性好等特点，特别适用于分离高沸点、难挥发、热稳定性差的高分子化合物，能满足环境分析的这些要求，特别是对有机污染物的分析，更是其它分析手段难以比拟的。 同时，离子色谱法的迅速发展，使得高效液相色谱法在测定有机和无机阴离子方面取得很好的成效。因此近年来高效液相色谱在大气、水质、土壤、生物等环境监测中得到了广泛地应用和发展。,大气、降水、废气等监测中的应用 大气中的污染物来源于工业废气、汽车尾气等,其中严重影响人体健康的有机污染物主要为多环芳烃类化合物,如萘、蒽、菲、苯并芘等,以及醛、酮类化合物等,对这些化合物都可用HPLC检测。 美