级硕士高级免疫学实验技术-W.ppt

高级免疫学实验技术 2012级硕士研究生,吉林大学白求恩医学院 免疫学系,免疫印迹 Western blotting,Western blotting,是一种在固相膜上如硝酸纤维素(NC)膜进行的抗原抗体反应。蛋白质经过电流作用后，可以从胶转移至膜上，再与特异性抗体孵育，洗去游离的抗体，然后和酶标记的二抗孵育，再进行底物显色。由于抗原抗体反应特异性好，亲合力高，Western blotting检测的灵敏度较高。,物品准备,实验步骤,SDS-PAGE Protein Blotting Immuno-Detection,实验步骤,SDS-PAGE Protein Blotting Immuno-Detection,SDS-PAGE实验步骤,组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。 灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O 封盖，在室温下聚胶30min。 倒掉dH2O ，且dH2O冲洗，然后用滤纸片将水吸干。 加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。 装入电泳槽，固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液 。 平稳拔下梳子,内槽液体量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。 用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品，30l/well。 接通电源，200V(恒压)进行电泳，当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时，终止电泳。 小心将胶取下，注意不要将胶破坏，准备转膜。,Start,胶的配制：,制胶注意,丙烯酰胺凝胶用过硫酸铵（Ap）聚合后，TEMED（四甲基乙二胺）加速催化Ap自由基的释放，加速胶的聚合，所以准备工作做好后再加TEMED。 注意操作过程中不要混入气泡，否则容易影响电泳时电流的通过。影响蛋白质迁移的速率。 用玻璃板制板时夹夹子对称，稍微靠下，以免夹碎玻璃板。,胶的配制：,灌 胶：,先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O 封盖，在室温下聚胶30min。,SDS-PAGE实验步骤,组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。 灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O 封盖，在室温下聚胶30min。 倒掉dH2O ，且dH2O冲洗，然后用滤纸片将水吸干。 加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。 装入电泳槽，固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液 。 平稳拔下梳子,内槽液体量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。 用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品，30l/well。 接通电源，200V(恒压)进行电泳，当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时，终止电泳。 小心将胶取下，注意不要将胶破坏，准备转膜。,Start,蛋白变性,不同的蛋白带有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与还原剂(低分子量的硫醇-2-ME/DTT)并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。,上样缓冲液包括： SDS-负电荷 溴酚兰- 指示剂 甘油-下沉 二巯基乙醇-解链 使蛋白质成线性 TrisHCL-缓冲液,SDS-PAGE实验步骤,组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。 灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O 封盖，在室温下聚胶30min。 倒掉dH2O ，且dH2O冲洗，然后用滤纸片将水吸干。 加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。 装入电泳槽，固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液 。 平稳拔下梳子,内槽液体量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。 用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品，30l/well。 接通电源，200V(恒压)进行电泳，当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时，终止电泳。 小心将胶取下，注意不要将胶破坏，准备转膜。,Start,SDS-PAGE实验步骤,组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。 灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O封盖，在室温下聚胶30min。 倒掉dH2O，且dH2O冲洗，然后用滤纸片将水吸干。 加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。 装入电泳槽，固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液 。 平稳拔下梳子,内槽液体量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。 用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品，30l/well。 接通电源，200V(恒压)进行电泳，当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时，终止电泳。 小心将胶取下，注意不要将胶破坏，准备转膜。,Start,SDS-PAGE实验步骤,组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。 灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加DW 封盖，在室温下聚胶30min。 倒掉DW，且DW冲洗，然后用滤纸片将水吸干。 加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。 装入电泳槽，固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液 。 平稳拔下梳子,内槽液体量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。 用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品，30l/well。 接通电源，200V(恒压)进行电泳，当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时，终止电泳。 小心将胶取下，注意不要将胶破坏，准备转膜。,Start,+,-,PAGE：PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳),M Sample,实验步骤,SDS-PAGE Protein Blotting Immuno-Detection,8KD,蛋白印迹(Protein Blotting),Gel,Membrane,M Sample,蛋白印迹实验步骤,将膜、滤纸片剪成合适大小，用转移缓冲液浸5分钟。 按图所示安装转印槽(膜略大于凝胶，并且滤纸和凝胶精确对齐，注意在胶和膜之间不要产生气泡)。 正确安装后，稳流100 mA, 转膜30 mins。 将膜取出，放入塑料盒内，用0.1M PBS洗净粘在膜上的凝胶。 用dH2O冲洗一遍。,转印安装示意图,吸水纸 5张,吸水纸 5张,注意：膜和胶的位置不能放反，且膜略大于胶。,膜,胶,蛋白印迹实验步骤,将膜、滤纸片剪成合适大小，用转移缓冲液浸5分钟。 按图所示安装转印槽(膜略大于凝胶，并且滤纸和凝胶精确对齐，注意在胶和膜之间不要产生气泡)。 正确安装后，稳流100 mA, 转膜30 mins。 将膜取出，放入塑料盒内，用0.1M PBS洗净粘在膜上的凝胶。 用dH2O冲洗一遍。,实验步骤,SDS-PAGE Protein Blotting Immuno-Detection,免疫学检测实验步骤,封闭：放入封闭液（含3%BSA的PBS-T） 10ml 中封闭 ，先在摇床上摇10min，然后放入37 孵箱中放置60min。 孵育结束后，直接向封闭液中加入靶抗原特异的一抗（1:100），先在摇床上摇10min，再放入 37孵箱中孵育30min. 用PBS-T洗三次，每次5min (在摇床上摇)。 弃去洗涤液，加入用1%BSA-PBS-T稀释的酶标二抗(HRP-DaR) 1:500，先在摇床上摇10min，再放入 37孵箱中孵育30min。 用PBS-T洗三次，每次5min (在摇床上摇)。 加入新配制的DAB底物液，显色，待显出明显条带时用dH2O终止反应。,一抗（特异性抗体）,洗涤，辣根过氧化物酶标记的二抗,底 物,免疫学检测(Immuno-detection),Example of immunoblotting,免疫学检测实验步骤,封闭：放入封闭液（含3%BSA的PBS-T） 10ml 中封闭 ，先在摇床上摇10min，然后放入37 孵箱中放置60min。 孵育结束后，直接向封闭液中加入靶抗原特异的一抗（1:100），先在摇床上摇10