高效毛细管电泳分离氨基酸.ppt

毛细管电泳 capillary electrophoresis (CE),1.1 概述（generalization）,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,-,+,+,-,+,-,1.2 经典电泳分析,利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。,1937年，蒂塞利乌斯（ Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在 两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将 人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖。,1.3 高效毛细管电泳分析,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了25100m 内径的毛细管,； 二是采用了高达数千伏的电压。,1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细 管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生 了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新 的分离分析技术高效毛细管电泳（HPCE）。,高效毛细管电泳的优势,侧面/横截面比的增大使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达105106板/米，毛细管凝胶电泳可以达到107。 微量：进样量只需150nl。 快速：几十秒到几十分钟就能完成分离。 广泛：样品范围可包括无机离子、氨基酸、蛋白质，甚至整个细胞。,高效毛细管电泳的应用,2.1 电渗现象electroosmosis,当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种定域电荷，因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成高出溶液本体的“自由”离子，即形成双电层，二者之间存在电位差。 在液体两端施加电压时，由于定域电荷无法移动，而双电层中的“自由”离子在电泳过程中通过碰撞等作用给溶剂分子施加单向推力，使之同向运动，并通过粘滞阻力带动周围溶剂运动，从而发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。,定域电荷：牢固结合在固体表面，在电场的作用下不能迁移的离子或带电基团。,2.2 高效毛细管电泳中的电渗流,以毛细管空管电泳为例，在高电场的作用下，管壁硅醇基电离，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，受液体黏度的阻力作用，引起柱中的溶液整体向负极移动，形成电渗流。,2.3 HPLC与HPCE的流形比较,HPLC压力驱动：溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍。 HPCE电场驱动：电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动，谱带展宽较小，分离效率高。,2.4 高效毛细管电泳电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + =电渗流 + 电泳 阳离子运动方向与电渗流一致； - =电渗流 电泳 阴离子运动方向与电渗流相反； 0 =电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致； （1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性； （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 基于各被测物净电荷与质量比存在差异。不同离子表面电荷密度的差异使其以不同的速度在电解质中移动，最后达到分离。,3.1 高效毛细管电泳仪,电压：030kV； 分离柱为毛细管空管，内径100m； 紫外检测器，检测波长280nm； 缓冲液：5mM NaH2PO4缓冲液（pH3.0）； 样品：色氨酸(0. 50g/L)、酪氨酸(饱和)的混合稀盐酸溶液。,3.2 毛细管的结构,毛细管是CE分离的心脏。理想的毛细管必须是电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛细管内径一般为10 100m，其截面结构图标意图如图17.23所示。,3.3 紫外吸收装置,检测窗口制作：浓硫酸接触法、灼烧法和刀片刮除法,3.4 示例,该例中管壁定域电荷呈电正性，电渗流方向为负极流向正极。 出峰顺序为：负离子中性粒子正离子； 带相同电性情况下，荷质比较大的离子先出峰。,3.5 分离度计算,Rs分离度； t1,t2保留时间，出峰时间； W1,W2峰宽。,4 姚老师的课题毛细管电色谱分离手性化合物,毛细管电色谱兼具HPCE的高效性和HPLC固定相具有高选择性的特点； 分类：开管柱、填充柱、整体柱；,5 习题,请用电渗的原理确定推测本实验中两个样品的出峰顺序。（四） 请以本实验为例列举两种色谱定性方法。(十) 请举出两种常用的色谱定量的方法。(十二） 查阅文献，请举一毛细管电泳具体应用的实例。(九) 若在本实验的缓冲液中分别加入十二烷基三甲基溴化铵（阳离子表面活性剂），或十二烷基磺酸钠（阴离子表面活性剂），请推测电渗流的大小和方向以及样品的出峰顺序会产生何种变化，为什么。(七) 若在本实验的缓冲液中加入有机溶剂甲醇，请推测电渗流会产生何种变化，为什么。 若提高本实验的缓冲液中的磷酸二氢钠的浓度，请推测电渗流会产生何种变化，并且此变化会对样品的检测产生何种影响？(五),请解释下列名词：电泳、电渗（双电层、定域电荷）、淌度。(第六组) 若将本实验的缓冲液改成壳聚糖乙酸缓冲液（壳聚糖在电解液中带正电），请推