HPLC法测定牛黄清胃丸中大黄素和大黄酚的含量.doc

HPLC法测定牛黄清胃丸中大黄素和大黄酚的含量【摘要】 目的：建立牛黄清胃丸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：SHIMADZU VP-ODS（250 mmX4.6 mm,5 um），流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80：20，V/V），流速：1.0mlmin-1，检测波长：254nm，柱温：30。结果：大黄素在10.0450.20gml-1范围内线性关系良好（r =0.9998）；平均加样回收率为97.6%， RSD=3.4%（n=6）；大黄酚在20.0460.12gml-1范围内线性关系良好（r =1.0000）；平均加样回收率为98.5%， RSD 3.1%（n=6）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于牛黄清胃丸的质量控制。 【关键词】 高效液相色谱法 牛黄清胃丸 大黄素 大黄酚 含量测定 Determination the content of Emodin and Chrysophanol in Niuhuangqinwei pills by HPLC 【Abstract objective】To establish a HPLC method for determination the content of emodin and chysophanol in Niuhuangqingwei pills. METHOD: The shimadzu VP-ODS C18(250 mm4.6 mm,5 um) was used, the mobile phase was methanol-0.1% phosphoric acid solution(80:20), the column temperature was 30 ,the detection wavelength was 254 nm.the flow rate was 1.0mlmin-1. RESULTS The linear ranges of emodin and chrysophanol were at 10.04-50.20 ug(r=0.999 8) and 20.4-60.12 ug.ml-1(r=1.000 0) respectively, the average recoveries(n=6) were 97.6% and 98.5% with RSD 3.4% and 3.1% respeclivery. CONCLUSION The method is simple and accurate, it can be used for quality control of Niuhuangqingwei pills. 【Key words】 HPLC; Niuhuangqingwei pills; emodin;chrysophanol; determination 牛黄清胃丸为卫生部药品标准第一册（中药成方制剂）收载的品种，由牛黄、大黄、菊花、黄芩、黄柏、桔梗、麦冬等17味中药组成，具有清胃泻火、润燥通便之功效。临床用于心胃火盛，头晕目眩，口舌生疮，牙龈肿痛，乳蛾咽痛，便秘尿赤1，疗效良好。处方中大黄为君药之一，大黄素和大黄酚为其主要有效成分，原标准中只有显微鉴别。为了更好地控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定牛黄清胃丸中大黄素和大黄酚的含量，以期为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。 1 仪器与试药 LC2010A 高效液相色谱仪，CLASSVP 色谱工作站；大黄素对照品（批号：110756-200110），大黄酚对照品（批号：110796-200310），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；牛黄清胃丸为市售样品（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，规格6g/丸，批号： 6015504，7013189，7011172）。甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱：SHIMADZU VP-ODS(250 mm4.6 mm,5 um)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80：20，V/V）；检测波长：254nm；流速：1.0mlmin-1；柱温：30。 2.2 溶液制备 2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥12h以上的大黄素对照品和大黄酚对照品各适量，分别加甲醇制成每1ml各含0.1mg的对照品贮备液；再精密量取大黄素对照品贮备液和大黄酚对照品贮备液各适量，加甲醇制成每1ml含大黄素15g、大黄酚25g的混合溶液，作为对照品溶液。 2.2.2 供试品溶液的制备 取重量差异项下的牛黄清胃丸，剪碎，混匀，取约6g，精密称定，置烧杯中，加水5ml，置水浴温热并搅拌使溶散，加硅藻土5g，拌匀，置100烘箱中，烘干，转移至锥形瓶中，并用水5ml洗涤烧杯及玻棒，洗液并入锥形瓶中，置100烘箱中，烘干，精密加入盐酸-乙醇（1：25）混合溶液50ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率50kHz）10 min，置水浴上加热回流2 h，放冷，再称定重量，用盐酸-乙醇（1：25）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液2。 2.2.3 阴性对照溶液的制备 取除大黄以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成大蜜丸，再按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。 2.3 专属性试验 分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10l注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间（1.大黄素：15.692min；2. 大黄酚：20.110 min）的色谱峰，阴性试验无干扰。 2.4 线性关系考察 精密吸取对照品贮备液（大黄素：0.1004mgml-1 ，大黄酚0.1002 mgml-1）各适量，分别置于10ml量瓶中，加甲醇定容，配成浓度分别为大黄素：10.04、20.08、30.12、40.16、50.20gml-1，大黄酚：20.04、30.06、40.08、50.10、60.12gml-1的溶液，摇匀，滤过，精密吸取续滤液各10l，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，经线性回归，大黄素回归方程为：A=5.79X107C-2.72X104，r =0.9998；大黄酚回归方程为：A=43.3X107C-3.74X104，r =1.0000。结果表明，大黄素在10.0450.20gml-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系；大黄酚在20.0460.12gml-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。 2.5 精密度 取对照品溶液，重复进样5次，进样量10l，在上述色谱条件下求得大黄素峰面积的RSD为0.9%，大黄酚峰面积的RSD为1.1%(n=5)。 2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，在0、6、1、24、48 h分别进行测定，峰面积结果，大黄素峰面积的RSD为0.6%，大黄酚峰面积的RSD为0.8%(n=5)。 2.7 重复性试验 取供试品（批号6015504）共5份，分别按“2.2.2”方法制备供试品溶液，进行测定，求得大黄素含量的RSD为1.6%，大黄酚含量的RSD为1.3%(n=5)，表明重复性较好。 2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（批号6015504，大黄素含量0.066mgg-1，大黄酚含量0.098 mgg-1，平均丸重2.940g丸-1）适量，共6份，分别置烧杯中，分别精密加入大黄素对照品贮备液（0.1004mgml-1）、大黄酚对照品贮备液（0.1002 mgml-1）3.5及4.5 ml各适量，按 “2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，依法测定，结果见表13。表1 大黄素、大黄酚加样回收率试验 2.9 样品含量测定 分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定三批样品中大黄素、大黄酚峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表2。 表2 3批样品含量测定结果（ 3 讨论 3.1 试验中曾试用过流动相：甲醇-0.05%高氯酸溶液（73：27）4，后又反复试用过不同比例的甲醇和不同浓度的磷酸溶液作为流动相进行分离，结果甲醇-0.1%磷酸溶液（80：20，V/V）能使样品峰与相邻杂质峰达到基线分离。 3.2 通过对3批样品中大黄素、大黄酚的测定，结果表明大黄素最高含量为0.41mg丸-1，最低为0.33mg丸-1；大黄酚最高含量为0.64 mg丸-1，最低为0.52mg丸-1。综合考虑确定限量，每丸含大黄素不得低于0.25mg，含大黄酚不得低于0.30mg。 3.3 本方法结果准确，方法简便，重复性及回收率均理想