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-氨基丙腈抑制赖氨酰氧化酶对小鼠免疫功能的影响【摘要】 目的 观察-氨基丙腈(-Aminopropionitrile，BAPN)抑制赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)后小鼠免疫功能的变化。方法 选用1822g的正常ICR小鼠，以-氨基丙腈100mg/kg连续灌胃10d。处死后检测小鼠胸腺重、脾重、巨噬细胞吞噬功能；采用绵羊红细胞作为抗原，检测小鼠抗体生成细胞功能；采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对ConA刺激的转化能力。结果 以-氨基丙腈抑制LOX活性，明显降低小鼠胸腺/体重比值；巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均下降；小鼠抗体生成细胞数减少；ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力减弱。结论 -氨基丙腈抑制赖氨酰氧化酶可减弱小鼠免疫功能。 【关键词】 赖氨酰氧化酶；-氨基丙腈；免疫功能；小鼠Abstract: Objective To explore the changes of immune function in mice after lysyl oxidase (LOX) was inhibited by -Aminopropionitrile (BAPN). Methods Normal ICR mice with weight of 1822 grams were divided into two groups. The experimental group was intragastric administration of BAPN with dose 100mg/kg for 10 days. After killing the mice, weights of thymuses and spleens, and the macrophage phagocytosis were detected. Using sheep red blood cells as antigen, the amounts of antibody-producing cells in mice were counted. Through lymphocyte conversion test, lymphocyte conversion ratios of spleen lymphocytes stimulated by ConA in mice were determined. Results After LOX activities were inhibited by BAPN, the thymus/ body weight ratios of mice were reduced significantly in experimental group. The phagocytic rates and phagocytic indexes of macrophages were significantly decreased. The numbers of antibody-producing cells declined. In the meanwhile, con A-induced lymphocyte conversion ratios of mice spleen lymphocytes were weakened. Conclusion Inhibition of LOX by BAPN can decrease the immune function in mice.Key words: lysyl oxidase； -Aminopropionitrile；immune function；mice赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)是一种细胞外依赖铜的氨基酸氧化酶，参与细胞外基质中胶原和弹性蛋白赖氨酸残基交联，在胶原和弹性蛋白由可溶性单体转变为不溶性纤维过程的初始阶段发挥重要作用1，对维持细胞外基质的结构和功能正常、组织器官发育、创伤修复、细胞运动等都具有重要意义2。-氨基丙腈(-Aminopropionitrile，BAPN)能抑制胶原交联的形成，是LOX不可逆的抑制剂3。本文以BAPN抑制LOX，进而从非特异免疫、体液免疫、细胞免疫三个方面初步研究小鼠免疫功能的变化。1 材料与方法1.1 材料 BAPN、刀豆蛋白A(ConA)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)均为美国SIGM公司产品(购自北京华美生物科技有限公司、北京思语生物科技有限公司)；胎牛血清(购自北京拜尔迪生物科技有限公司)；RPMI-1640培养基为美国GIBCO公司产品(购自北京拜尔迪生物科技有限公司)；选用宁夏医学院实验动物中心提供的清洁级ICR小鼠。1.2 方法 选用1822g的小鼠，随机分成两组：每组8只，雌雄各半，BAPN实验组按100mg/kg 给予BAPN(用生理盐水配制)，正常对照组给予生理盐水0.1mL，每天灌胃1次，连续10d后脱颈椎处死，分别测定以下各项指标。1.2.1 小鼠免疫器官相对重量(脏器/体重比值) 小鼠称体重后脱颈椎处死，常规解剖取小鼠脾脏和胸腺，计算脏器/体重比值。1.2.2 巨噬细胞吞噬功能测定 于试验前一天给小鼠腹腔注射无菌肉汤1mL，次日，注射1.5绵羊红细胞(SRBC)悬液1mL于小鼠腹腔内，注射后轻揉小鼠腹部，30min后将小鼠用颈椎脱臼法处死，剪开腹部皮肤，用尖吸管注入5mL预温的Hanks液并吸取腹腔液，把腹腔液滴加到洁净的载玻片上，每片约0.10.2mL，每只重复做片2张；将载玻片放置湿盒中，37培养箱孵育30min；取出载玻片，用0.86盐水洗去上清液和未黏附在玻片上的细胞；室温下晾干后用Giemsa染液染色14min，冲洗去多余的染液，晾干；油镜下观察计数100个巨噬细胞中吞噬有SRBC的细胞数，并计数被巨噬细胞吞噬SRBC的数量，按以下公式计算出每组小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数： 吞噬百分率=吞噬SRBC的巨噬细胞数/巨噬细胞总数100 吞噬指数=被吞噬的SRBC数/吞噬SRBC的巨噬细胞总数1.2.3 体外抗体形成细胞检测液相小室法 将5SRBC(0.4mL)注射于小鼠腹腔，4d后脱颈处死，取出脾脏放在已加入7mL Hanks液的平皿中。在100目不锈钢网上研磨，过滤混匀。将脾细胞悬液20L，SRBC 50L，补体100L，Hanks液180L混匀后用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内，置37孵箱1.5h。观察小室内的透明空斑，一个空斑即代表一个空斑形成细胞(PFC)，即B细胞。小室是用双面胶将两张无脂载玻片(75mm25mm)黏合而成。1.2.4 T淋巴细胞转化试验 脱颈处死小鼠后，于超净台中无菌取出脾脏，置于盛有Hanks液的平皿中，在100目不锈钢网上研磨成单细胞悬液置于离心管中，1500r/min离心5min，弃上清，同样方式洗涤细胞2次，然后用RPMI-1640培养液制备3106个/mL脾细胞悬液。将细胞悬液分6孔加至96孔培养板中，100L/孔，3个孔加ConA液100L，另3个孔作为对照，置5%CO2，37条件下培养72 h。培养结束前4h，每孔加入MTT 20L(5mg/mL)，继续培养4h。培养结束后，每孔吸出0.1mL液体，加入0.1mL DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪，在波长490 nm处测定OD值。1.3 统计学方法 实验数据用SPSS 11.5软件进行统计分析，计量资料以xs表示，采用t检验法比较组间差别，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 BAPN抑制LOX对小鼠脏器系数的影响 与对照组比较，实验组小鼠胸腺/体重比值下降(P0.01)，脾脏/体重比值差异无统计学意义(P0.05)，见表1。2.2 BAPN抑制LOX对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 实验组小鼠巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬率和吞噬指数较对照组均明显降低(P0.01)，表1。表1 BAPN抑制LOX对小鼠免疫功能的影响(略) 2.3 BAPN抑制LOX对小鼠体外抗体形成细胞的影响 用液相小室法测定，实验组小鼠脾脏细胞的空斑形成数明显少于对照组，即实验组小鼠抗体生成细胞数较对照组明显减少(P0.01)，表1。2.4 BAPN抑制LOX对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验的影响 由表1可看出，实验组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力与对照组比较有明显下降(P0.01)。3 讨论 LOX存在于人类、小鼠、大鼠、鸡、鱼等多种生物体中，广泛分布于多种组织器官，如心、肝、肺、子宫、卵巢、皮肤1，4。研究证明，LOX表达增高与动脉硬化5、硬皮病6、肝硬化7等一些纤维化疾病的发生有关；LOX表达降低与皮肤松弛8、Menkes syndrome9-10、 Ehler-Danlos syndrome11等疾病的发生有关，但目前国内外尚未见有关LOX对免疫功能影响的报道。本研究参照文献12采用100mg/kg BAPN来抑制实验组小鼠的LOX酶活性，初步检测细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫的变化趋势。 免疫器官是免疫细胞发生分化、发育、成熟及发生免疫应答的场所，胸腺和脾是机体中重要的中枢免疫器官和外周免疫器官，其重量的大小在一定程度上与机体免疫功能的强弱有关。表1显示，LOX的活性被抑制后，小鼠胸腺/体重比值明显下降，说明抑制LOX后可抑制小鼠胸腺的发育。 巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的检测，可作为机体非特异性免疫功能的一项重要指标。本实验的结果显示，经口给予小鼠BAPN后，巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均明显降低，揭示LOX的活性下降可抑制巨噬细胞的吞噬功能，进而抑制机体的非特异免疫。 用绵羊红细胞作为抗原刺激小鼠，小鼠脾脏内的抗体生成细胞可释放抗绵羊红细胞抗体。用液相小室法检测，抗体生成细胞可释放抗体，结合周围的绵羊红细胞，并在补体参与下导致绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑，空斑数反映抗体生成细胞数。从表1结果可见，抑制LOX可减少小鼠抗体生成细胞数，提示小鼠特异性体液免疫功能被抑制。 淋巴细胞转化实验可对细胞免疫功能进行检测。在本实验中，实验组小鼠的T细胞转化能力与对照组比较有明显下降。表明抑制LOX后，小鼠细胞免疫功能也降低。 综上所述，以-氨基丙腈抑制LOX的酶活性对小鼠的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫的功能均有不同程度的抑制作用，其机制尚待进一步研究。【参考文献】 1Csiszar K. Lysyl Oxidase：A Novel Multifunctional Amine Oxidase FamilyJ. Prog Nuclei Acid Res Mol Biol，2001，70：1-32.2Kagan HM，Li W. Lylyl oxidase：properties，specificity，and biological roles inside and outside of the cellJ. Cell Biochem，2003，88(4)：660-672.3McGowan KB，Sah RL. Treatment of cartilage with -aminopropionitrile accelerates subsequent collagen maturation and modulates integrative repairJ. J Orthop Res，2005，23(3)：594-601.4Lucero HA，Kagan HM. Lysyl oxidase：an oxidative enzyme and effector of cell functionJ. Cell Mol Life Sci，2006，63(19-20)：2304-2316.5Kagan HM，Raghavan J，Hollander W，et al. Changes in aortic lysyl oxidase activity in diet-induced atherosclerosis in the rabbitJ. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1981，1：287-291.6Chanoki M，Ishii M，Kobayashi H，et al. Increased expression of lysyl oxidase in skin with sclerodermaJ. British Journal of Dermatology，1995，133(5)：710-7157Kagan HM. Lysyl oxidase：mechanism，regulation and relationship to liver fibrosisJ. Pathol Res Pract，1994，190(9-10)：910-919.8Thomas R，Trompeter R，Duffy P，et al. Congenital cutis laxa and lysyl oxidase deficiencyJ. Clin Genet，1997，51(2)：109-114.9Poyne AS,Gitlin BD. Functional Expression of the Menkes Disease Protein Reveals Common Biochemical Mechanisms Among the C