健脾止动汤对多发性抽动症模型鼠纹状体多巴胺通路的影响.doc

健脾止动汤对多发性抽动症模型鼠纹状体多巴胺通路的影响作者：卫利,王素梅,岳广欣,吴力群,郝宏文,张婷,陈自佳,刘岩,胡利军【摘要】 目的 研究健脾止动汤对多发性抽动症(TS)模型鼠纹状体多巴胺通路的影响,为健脾止动汤干预小儿TS提供神经生化学依据。方法 90只雄性ICR小鼠随机分成6组,即空白组、模型组、泰必利组、健脾止动汤组、六君子汤组、泻青汤组。除空白组外,其余5组小鼠腹腔注射亚氨基二丙腈建立TS小鼠模型。除空白组和模型组给予生理盐水外,其余4组分别灌胃给予相应药物。4周后采用高效液相色谱电化学法测定TS模型鼠脑纹状体单胺类递质的含量。结果 TS模型鼠表现出抽动症特征性的运动行为和刻板行为。小鼠脑纹状体单胺类递质含量,模型组较空白组脑多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)含量无明显变化(P0.05)；泻青汤组较模型组DA、DOPAC含量降低(P0.05),泻青汤组较泰必利组脑DA、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、NE含量降低(P0.01或P0.05),泻青汤组较六君子汤组脑DA、5-HIAA、NE含量降低(P0.01或P0.05)。结论 健脾止动汤的主要作用组分为泻青汤,其抗抽动作用可能与兴奋脑纹状体多巴胺间接通路、降低DA含量有关。 【关键词】 多发性抽动症；纹状体；多巴胺通路；健脾止动汤；小鼠 Abstract：Objective To study the effects of Jianpizhidong decoction on dopamine pathway in TS model mice striatum, and provide neural biochemical proof for Jianpizhidong decoction in treating children Tourette syndrome (TS). Methods 90 male ICR mice were randomly divided into 6 groups, namely blank control group, model group, Tiapride group, Jianpizhidong decoction group, Liujunzi group, Xieqing group. Except blank control group, other 5 groups mice were made to TS models by intraperitoneal injection of 3, 3-Iminodipropionitrile (IDPN). With the exception of blank and model groups, other 4 groups were given corresponding drugs by intragastric administration respectively. 4 weeks later, the levels of monoamine neurotransmitter in brain striatum of TS model mice were detected by high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Results TS model mice appeared characteristic locomotion behavior and stereotypy behavior. The levels of monoamine neurotransmitters with the exception of 5-HIAA had no difference in striatum of mice between TS model group and blank control group (P0.05). Compared with model group, levels of DA and DOPAC in striatum reduced in Xieqing group (P0.05). Compared with Tiapride group, levels of DA, 5-HIAA, NE in striatum reduced in Xieqing group (P0.01, P0.01, P0.05). Compared with Liujunzi group, levels of DA, 5-HIAA, NE in striatum reduced in xieqing group (P0.01, P0.01, P0.05). Conclusions The mainly component of Jianpizhidong decoction is Xieqing decoction, the function of improving symptoms of TS maybe relate to activate indirect dopamine pathway and decrease levels of DA in TS model mice striatum. Key words：TS model mice；striatum；dopamine pathway；Jianpizhidong decoction；mice 小儿多发性抽动症(Tourette syndrome,TS)是一种慢性神经精神障碍性疾病,以运动性抽动和发声性抽动为主要表现,病因和发病机制尚未阐明,目前多数学者认为可能与多巴胺(DA)、5羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)等单胺类递质异常有关1-2。目前临床上治疗TS主要以药物和心理干预为主,其中西药治疗以多巴胺受体阻滞剂(氟哌啶醇、泰必利等)为首选,但由于不良反应大、疗程长、停药后易复发,患儿依从性较差。北京中医药大学东方医院儿科王素梅主任医师在多年临床经验基础上,以健脾疏肝、化痰熄风立法,创制健脾止动汤,治疗小儿脾虚肝亢夹痰型TS,取得较好疗效,且复发少,无明显不良反应3。本研究拟通过建立TS小鼠模型,以泰必利做为阳性对照药,以健脾止动汤的拆方六君子汤、泻青汤作为对照中药,测定TS模型鼠脑纹状体单胺类递质的含量,探讨健脾止动汤对TS模型鼠纹状体多巴胺通路的影响,揭示健脾止动汤治疗TS的可能神经生化学机制,为其在临床进一步推广应用提供理论依据。1 实验材料1.1 动物 雄性健康ICR小鼠,体重(182)g,清洁级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号：SCXK(京)2007-0001。分笼喂养,自由采食,温度(233),通风,日光灯照明(8 am5 pm)。1.2 药物、试剂与仪器 盐酸泰必利片(泰必利片,江苏恩华),中药配方颗粒(江阴天江),标准品DA、NE、高香草酸(HVA)、5-HT、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、二羟苯乙酸(DOPAC)及DHBA(内标物)均购自Sigma,乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)、高氯酸、偏重亚硫酸钠、柠檬酸、柠檬酸三钠均为国产分析纯,1-庚烷磺酸钠(HPLC Grade),甲醇(高效液相色谱淋洗液),超纯水,液氮。美国ESA 5600A高效液相色谱8通道库仑阵列电化学分析系统,SIGMA 3K15台式低温高速冷冻离心机,过滤膜(孔径0.22 m),玻璃匀浆器。2 实验方法2.1 分组及造模 ICR雄性小鼠90只,随机分成6组,分别为空白组、模型组、泰必利组、健脾止动汤组、六君子汤组、泻青汤组,每组15只。分笼适应性喂养1周后开始造模。参照神经毒素全身用药法1,除空白组外,其余5组小鼠在灌胃给药后立即进行腹腔注射IDPN,为获得更明显的TS模型鼠的特征性行为改变(运动行为和刻板行为1),剂量由原文献报道的150 mg/(kgd)增至300 mg/(kgd),空白组腹腔注射等体积的生理盐水,每日1次,连续7 d。造模7 d后模型鼠均出现不同程度的运动行为(探究活动4-5增加)和刻板行为(头部抽动、旋转)1,且该行为表现不需特殊处理可一直持续2个月。2.2 给药 造模当天同时进行灌胃给药,以相当于儿童临床用药的5倍剂量20 mL/(kgd),空白组和模型组给予生理盐水,其余4组分别给予泰必利(按25 mg/kg配成混悬液)、健脾止动汤(太子参、炒白术、茯苓、羌活、防风、龙胆草等,1 mL含1 g原药材)、六君子汤(太子参、炒白术、茯苓、法半夏、陈皮,1 mL含0.35 g原药材)、泻青汤(羌活、防风、栀子、龙胆草、川芎、当归、酒大黄,1 mL含0.45 g原药材),每日1次,连续4周。2.3 指标测定2.3.1 色谱条件参照文献4方法,美国ESA 5600A高效液相色谱8通道库仑阵列电化学分析系统,色谱柱：ESA HR-80 (4.6 mm8 cm),流动相：71 mmol/L一水柠檬酸、75.8 mmol/L柠檬酸三钠、0.13 mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0.42 mmol/L 1-庚烷磺酸钠、6%甲醇,0.22 m滤膜过滤,超声脱气10 min。柱温30 ,流速0.6 mL/min,电势设置-50、100、300、500 mV,进样量20 L。2.3.2 纹状体单胺类递质检测灌胃4周,末次给药24 h后,断头取脑,冰盒上快速剥离小鼠脑纹状体,电子天平称重,铝箔包好,按组分装入纱布袋,置液氮罐待测。 将脑纹状体放到玻璃匀浆器中,每50 mg纹状体加入预冷的500 L脑组织递质工作液4(EDTA-Na2 200 mg,偏重亚硫酸钠200 mg,含0.1 mg/mL DHBA的内标液100 L,加0.2 mol/L高氯酸溶液定容至500 mL),冰上快速匀浆,吸取匀浆液,4 、 14 000 g 离心15 min,取上清进样检测DA、5-HT、NE、DOPAC、HVA、5-HIAA含量。3 统计学方法 定量资料用xs表示,采用SPSS15.0软件包,对正态分布数据,采用单因素方差分析,方差齐,采用LSD检验(P0.05),方差不齐,采用Games-Howell检验(P0.05)。对偏态分布数据,采用非参数检验。4 结果(见表1)表1 药物对TS小鼠脑纹状体单胺类递质含量的影响(略)注：与模型组比较,P0.05,P0.01；与泰必利组比较,P0.05,P0.01；与六君子汤组比较,P0.05,P0.01； 与健脾止动汤组比较,P0.055 讨论 TS发病可能与遗传因素、神经生理、生化代谢(如神经递质失衡)、心理因素、环境因素等相互作用有关6。多数学者认为主要与DA、5-HT、NE等单胺类递质异常有关。可能病机为TS患儿DA突触后受体超敏感,负反馈调节机制启动,代偿以突触前DA释放减少以维持DA能系统平衡,当DA失代偿时,5-HT和NE能系统参与调节平衡,此时患儿不发病或抽动症状轻微,若5-HT和NE能系统失代偿,患儿则出现明显的抽动症状2。 DA由其前体酪氨酸经过一系列酶促反应在脑DA能神经元中合成,释放到神经突触间隙,与DA受体结合,发挥调节躯体运动和精神活动等生理作用1,7,HVA、DOPAC是DA的主要代谢产物1。DA能神经元主要位于黑质纹状体多巴胺通路,该神经环路有二：直接通路和间接通路,作用相反8。直接通路中黑质致密部合成DA,与D1受体(多巴胺受体亚型)结合,Gs(兴奋性G蛋白)介导,激活AC(腺苷酸环化酶),兴奋运动；间接通路中黑质合成的DA与D2受体结合,Gi(抑制性G蛋白)介导,抑制AC,抑制运动7-8。分布在DA神经元胞体-树突上的D2受体作为DA自身受体,负反馈调节DA神经元的放电活动；分布在DA神经元末梢的D2受体成为突触前DA受体,导致DA合成的限速酶TH(酪氨酸羟化酶)磷酸化受抑制,DA合成减少7。 关于DA在TS模型中的变化报道不一9-10。实验中模型鼠脑纹状体中DA含量与空白组比较无明显变化,支持TS发病是突触后受体超敏感的功能性改变。泻青汤组DA含量较模型组下降,提示泻青汤可能兴奋间接通路,促使内源性DA与突触前DA受体结合,启动负反馈调节,减少神经元胞体DA合成,对抗突触后超敏感的受体。泻青汤组DA含量较泰必利组下降,泰必利组DA含量较模型组无明显变化,提示DA受体阻滞剂泰必利与泻青汤可能从不同的环节干预TS,推测泰必利可能兴奋间接通路中分布在DA神经元胞体-树突上的D2受体,抑制DA神经元电活动,从而发挥抗抽动作用。上述关于药物与DA受体相互作用的推论,需在下一步的实验中,通过放射配体结合、自显影技术进一步证实。模型组与空白组比较,DA的代谢产物之一HVA在纹状体中的含量无明显变化。DA代谢产物DOPAC在泻青汤组下降,与泻青汤组DA的变化一致,与文献报道的模型鼠脑纹状体中递质变化趋势一致9,11。泻青汤组DA含量较六君子汤组下降,较健脾止动汤组变化不明显,提示泻青汤为健脾止动汤的主要作用组分。健脾止动汤加入六君子汤组分,一为复方中苦寒药物容易损伤小儿娇嫩的脾胃,用六君子汤补益中焦,体现顾护小儿脾胃的思想；二为扶土抑木法的体现；三为根据“见肝之病,知肝传脾,当先实脾”理论,既病防变。 5-HT主要存在于消化道细胞,中枢神经系统含量少,5-HT由前体色氨酸经过酶促反应在5-HT能神经元合成7,5-HIAA是5-HT的主要代谢产物1。5-HT受体分7类10亚型,其中5-HT1B、5-HT4受体分布在基底神经节等与DA功能相关的脑区,作为自身受体或异种受体,调节中枢5-HT、DA、Ach(乙酰胆碱)等神经递质的释放7。实验中六君子汤组5-HIAA含量较泻青汤组升高,5-HT含量较泻青汤组有升高趋势,推测可能为健脾止动汤、六君子汤兴奋5-HT1B受体和5-HT4受体,促进DA、Ach释放,以平衡泻青汤降低DA合成所可能导致的影响。因此,健脾止动汤不是泻青汤和六君子汤的简单相加,不能由泻青汤或六君子汤直接代替。 NE的前体是DA,主要存在于蓝斑的NE能神经元,可能与情绪反应有关8。实验中泻青汤组NE含量较泰必利组、六君子汤组降低,可能与其前体DA减少有关。 因此,健脾止动汤的主要作用组分为拆方泻青汤,其抗抽动作用可能与兴