全反式维甲酸上调异位子宫内膜间质细胞GJIC功能的机制.doc

全反式维甲酸上调异位子宫内膜间质细胞GJIC功能的机制 作者：刘志能，姚珍薇，唐良萏，卞度宏 【摘要】 目的： 探讨全反式维甲酸（ATRA）对人异位子宫内膜间质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)功能的调节作用及其机制. 方法： 取人子宫内膜异位症（EMs)患者的间质细胞，采用0.1，1，10 mol/L ATRA于24，48，72，96和120 h分别进行处理，同时设置空白对照组. 采用激光共聚焦显微镜检测异位内膜间质细胞的GJIC功能，并检测与GJIC功能密切相关的Cx43，Cx26和Cx32的基因及蛋白表达. 结果： 经ATRA处理后，1 mol/L与10 mol/L处理组的异位内膜间质细胞荧光恢复功能明显增强；0.1 mol/L处理组的异位内膜间质细胞荧光恢复功能无明显变化. 未经ATRA处理的异位内膜间质细胞中无Cx43，Cx26和Cx32 的mRNA及蛋白表达；经1，10 mol/L ATRA处理后，异位内膜间质细胞中检测到Cx43 mRNA和蛋白表达，但未见Cx26和Cx32 的mRNA及蛋白表达. 间质细胞的GJIC功能与去磷酸化Cx43蛋白的表达有关. 结论：ATRA能选择性的诱导Cx43基因及其去磷酸化蛋白的表达，从而上调异位内膜间质细胞的GJIC功能；ATRA酸可能是治疗EMs的潜在药物. 【关键词】 全反式维甲酸；间质细胞；间隙连接细胞间通讯；子宫内膜异位症【Abstract】 AIM: To explore the possible mechanism underlying the upregulation on gap junctional intercellular communication (GJIC) by alltransretinoic acid (ATRA) in human endometriotic stromal cells. METHODS: Ectopic endometrial stromal cells isolated from human endometriotic tissues were treated with 0.1, 1 and 10 mol/L ATRA for 24, 48, 72, 96 and 120 h, respectively, and control groups were introduced simultaneously. Laser scanning confocal microscope was applied to determine the function of GJIC in these stromal cells. Cx43, Cx26 and Cx32, which are associated with GJIC, were investigated at the mRNA and protein levels. RESULTS: The ability of fluorescence recovery was enhanced significantly in endometriotic stromal cells exposed to 1 and 10 mol/L ATRA. No evidence for fluorescence recovery was confirmed in endometriotic stromal cells treated with 0.1 mol/L ATRA. Cx43, Cx26 and Cx32 were not detected at mRNA and protein levels in control groups. Treatment of endometriotic stromal cells with 1, 10 mol/L ATRA for 72 h induced the expressions of Cx43 mRNA and protein while lost the same effects on Cx26 and Cx32. The function of GJIC in endometriotic stromal cells was only associated with dephosphorylated Cx43 protein. CONCLUSION: ATRA induces selectively the expressions of Cx43 mRNA and dephosphorylated Cx43 protein in endometriotic stromal cells, and then GJIC in these cells are effectively upregulated, which implys that ATRA may be a potential drug to administer the patients suffering from endometriosis.【Keywords】 alltransretinoic acid (ATRA); stromal cell, gap junctional intercellular communication (GJIC); endometriosis (EMs)0 引言 子宫内膜异位症(endometriosis, EMs)在育龄妇女中的发病率高达10%15%，常造成患者盆腔疼痛、性交不适甚至不孕，严重危害着患病妇女的身心健康1. 目前EMs的发病机制尚未阐明，现有的手术及药物治疗效果不甚理想. 已有的研究发现EMs异位内膜间质细胞的间隙连接细胞间通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能丧失，且与EMs的发病密切相关1-2. 人类子宫内膜间质细胞的GJIC功能主要决定于Cx43，Cx26和Cx32三种连接蛋白的表达，而新近的研究证实全反式维甲酸(alltransretinoic acid, ATRA)可有效上调或恢复人异位子宫内膜间质细胞的GJIC功能3，但相关调节机制尚不清楚. 我们通过体外细胞模型，研究ATRA对Cx43，Cx26和Cx32基因和蛋白表达的影响，旨在探讨ATRA用于EMs治疗的可能性.1 材料和方法1.1 材料 雌二醇，孕酮，ATRA和佛波酯(美国Sigma公司)；二醋酸羧基荧光素(美国BioChemika公司)；总RNA提取试剂，逆转录酶MMLV，RTPCR Kit，DNA marker(大连TaKaRa生物有限公司)；Cx43鼠抗人mAb，特异性的磷酸化蛋白检测抗体4G10（美国zymed公司）；Cx26，Cx32鼠抗人mAb，Western Blot化学发光试剂盒(美国santa cruz公司)；蛋白提取与分析试剂盒(上海生物工程有限公司)；120100显像胶片(美国Kodak公司)；TCSSP5型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司). Cx43，Cx26，Cx32及内参照actin引物采用primer 5软件设计，由上海生物有限公司合成，其引物系列见表1.表1 RTPCR引物系列（略）1.2 方法1.2.1 间质细胞的分组与处理 取本室冻存的异位内膜间质细胞1-2，复苏后按5104密度接种于直径为20 mm的圆形盖玻片上，置入6孔板培养；同时接种75 mL培养瓶内，放入50 mL/L CO2 37培养箱中，单层贴壁培养3 d后再作下述分组干预实验. 将上述6孔板中贴壁培养的单层细胞进行分组：按ATRA终浓度分为0.1，1，10 mol/L三个处理组，每组分别经ATRA处理24，48，72，96和120 h，同时设空白对照组，用于GJIC功能的检测. 收获经1，10 mol/L ATRA处理的瓶养细胞及同期对照组细胞分别用于RTPCR及Western Blot实验. 为了解间质细胞连接蛋白磷酸化状态与GJIC功能的关系，实验引入佛波酯连接蛋白磷酸化的刺激剂，佛波酯的终浓度为50 nmol/L，收获细胞前3 h加入培养基中. 所有细胞均添加生理剂量雌二醇和孕酮进行培养，其终浓度分别为170，200 pg/mL.1.2.2 间质细胞GJIC功能的检测 按文献3的方法，在激光共聚焦显微镜下，通过FRAP Wizard for Windows程序，采用荧光漂白后恢复技术，每组检测50个间质细胞. 整个光漂白实验在40 min内完成. 仪器参数设置参照厂商说明书. 数据及荧光漂白恢复率通过荧光强度自动定量程序获得.1.2.3 PTPCR检测Cx43，Cx26，Cx32 mRNA的表达 总RNA的提取以及逆转录实验均按说明书及试剂盒操作步骤进行. 采用MMLV标准体系，37反应60 min，99 5 min. PCR扩增采用50 L反应体系，内含cDNA 3.0 L，10buffer 5.0 L，25 mmol/L MgCl2 5 L，10 mol/L dNTP 4.0 L，EX Tag DNA聚合酶0.25 L，引物均为1.0 L，ddH2O 33.25 L. 整个反应体系按下述条件进行循环：95 5 min，94 35 s，60 30 s，72 1 min，共35个循环，扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶电泳30 min (80 V)，EB染色，图像分析仪上扫描分析.1.2.4 Western Blot检测Cx43，Cx26，Cx32蛋白的表达 收集细胞，制备匀浆，4下以12 000 g离心2次，每次10 min，取上清，在沸水浴中煮沸5 min，经蛋白分析试剂盒进行蛋白定量后，按下述方法行Western Blot检测： 制板后蛋白等量上样，进行120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.52 h； 在4下电转移至PVDF膜上，56 V电转2.5 h； 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭PVDF膜12 h； 分别加入Cx43，Cx26和Cx32鼠抗人mAb(原液按1500800稀释)孵育. 为检测Cx43的磷酸化状态，我们采用特异性的磷酸化蛋白检测抗体4G10 (1400稀释)，4过夜，TBST洗涤； 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（12000稀释），室温孵育1 h，TBST洗涤； 化学发光试剂显色，并置入暗室内与Kodak胶片贴近曝光，显影、定影后扫描分析. 统计学处理：数据采用SAS 9.0统计软件包处理，计量资料的数值以xs表示，各组间均数的多重比较比较采用LSDt检验；细胞GJIC功能与ARTA作用的时间及剂量关系采用多重线性回归分析. P0.05为差异具有统计学意义.2 结果2.1 ATRA对异位内膜间质细胞GJIC功能的影响 经1，10 mol/L ATRA处理2472 h后，异位内膜间质细胞的GJIC功能均明显增强，且10 mol/L处理组的细胞GJIC功能高于1 mol/L处理组(P0.05)，进一步分析发现，异位内膜间质细胞GJIC功能与ATRA作用时间、剂量呈正相关关系（相关系数r=0.714，0.652；P值均0.05). 1，10 mol/L ATRA处理组的细胞GJIC功能均高于同时段的0.1 mol/L ATRA处理组和对照组(P0.05).2.2 异位内膜间质细胞中Cx43，Cx26，Cx32 mRNA表达 对照组的异位内膜间质细胞未见Cx43，Cx26，Cx32 mRNA表达. 经1，10 mol/L ATRA处理后，琼脂糖凝胶电泳图上均可见168 bp大小的Cx43扩增条带，但未见Cx26和Cx32的mRNA扩增条带（图1）.M：marker；12：对照组；34：1 mol/L ATRA处理72 h; 5：阳性对照（小鼠心脏组织）; 6：空白对照组（未加Cx43引物）.图1 异位内膜间质细胞中Cx43 mRNA的表达（略）2.3 异位内膜间质细胞中Cx43，Cx26，Cx32 蛋白表达 对照组的异位内膜间质细胞中均未见Cx43，Cx26和Cx32的蛋白表达；ATRA处理后，可检测到41 ku大小的Cx43蛋白条带，且ATRA处理2472 h间，Cx43表达量递增，96 h与120 h的表达量无明显差异；不同处理时段均未见Cx26和Cx32的免疫印迹（图2）.13，7：未经处理的对照组；45，10：ATRA 处理72 h；6：阳性对照(小鼠心脏裂解液的蛋白提取物)；712：依次为处理24，48，72，96和120 h. D：A, B, C对应的内参tubulin；E：Cx43表达量与1 mol/L ATRA 处理时间的关系.图2 异位内膜间质细胞中Cx43，Cx26，Cx32 的蛋白表达（略）2.4 异位内膜间质细胞的Cx43磷酸化状态与GJIC功能的关系 经1 mol/L ATRA单独处理的异位内膜间质细胞中仅检测到41 ku大小的去磷酸化形式Cx43(P0)；加入佛波酯后(ATRA+佛波酯)，除了部分去磷酸化形式Cx43(P0)表达外，我们还检测到表达量更多的45 ku大小的磷酸化形式Cx43条带(P1)，此时，ATRA对间质细胞GJIC功能的上调作用被完全抑制，但Cx43蛋白的表达总量与ATRA单独处理时无明显差异(图3).12：1 mol/L全反式维甲酸 单独处理；34：1 mol/L全反式维甲酸+50 nmol/L佛波酯联合处理. P0：41 ku条带；P1：45 ku条带.图3 异位内膜间质细胞中Cx43的磷酸化状态（略）3 讨论 GJIC是多细胞生物体内最普遍的通讯方式，它对信息的调控是通过间隙连接的介导而实现的，cAMP，IP3，Ca2+等第二信使及水溶性小分子物质可以自由通过间隙连接. 完整的间隙连接由6个连接蛋白集聚而成，因此连接蛋白的不同表达量与活化状态决定着细胞的GJIC功能. 正常GJIC功能对子宫内膜细胞的诸多生理功能至关重要4-5. 在子宫内膜癌等妇科肿瘤中普遍存在GJIC功能异常，上调其GJIC功能，不仅能有效抑制癌细胞的增殖、侵袭、种植及转移，甚至恢复良性表型6. EMs亦具有类似恶性肿瘤的生物学行为. 本课题组前期研究已证实1-2，EMs患者异位内膜间质细胞的GJIC功能缺陷，其细胞的GJIC功能状态与Cx43蛋白表达水平密切相关. 这提示诱导间质细胞Cx43的表达或上调其GJIC功能将是治疗EMs的有效策略. 本研究中所有EMs病例的异位内膜间质细胞中均未见Cx43，Cx26及Cx32的蛋白表达，这与Regidor等7人在EMs患者异位内膜组织切片中观察到的结果一致. 1 mol/L与10 mol/L ATRA均能有效上调异位内膜间质细胞的GJIC功能，且最初的72 h内，异位内膜间质细胞GJIC功能与ATRA间有明显的量效和时效关系；但ATRA作用72 h以后，间质细胞的GJIC功能已达“饱和”状态. 这种“饱和”现象可能与连接蛋白的合成与降解平衡有关8. 0.1 mol/L ATRA没有上调间质细胞GJIC的作用，提示ATRA发挥其效应需达到一定的阈值浓度. 在异位内膜间质细胞中，ATRA仅选择性的诱导Cx43的转录与蛋白合成，对Cx26及Cx32却无类似作用，这与其他癌细胞株中的发现并不一致9，提示ATRA对不同连接蛋白的诱导作用可能具有细胞或组织特异性. 蛋白质磷酸化/去磷酸化是调节蛋白质功能和活性的最重要、最普遍的调节方式，磷酸化蛋白是大多数类型细胞的活性形式. 通过引入佛波酯连接蛋白的磷酸化刺激剂，我们证实了去磷酸化Cx43才是决定异位内膜间质细胞GJIC功能的活性形式. Nakagawa等10人发现，ATRA可拮抗佛波酯对细胞GJIC功能的抑制作用，但在人异位内膜间质细胞中，ATRA上调GJIC功能的作用则完全被佛波酯逆转，这种逆转作用尚未见于其他细胞类型. 综上所述， ATRA通过选择性的诱导Cx43基因及去磷酸化形式蛋白的表达， 从而有效上调人异位内膜间质细胞的GJIC功能. 结合前期的研究结果， 提示ATRA可能是治疗EMs的潜在药物， 但其具体的信号转导机制及安全性等诸多问题还有待进一步深入研究.【参考文献】 1 刘志能,姚珍薇,唐良萏,等. EMs异位及在位内膜间质细胞Cx43的表达及GJIC功能的体外研究J. 重庆医科大学学报, 2007, 32(10):1049-1054.2 刘志能,姚珍薇,唐良萏,等. 异位和正常子宫内膜间质细胞对上皮细胞间隙连接细胞间通讯的影响J. 第三军医大学学报,2007, 29(20):1972-1975.3 刘志能,姚珍薇,唐良萏,等. 全反式维甲酸对异位子宫内膜间质细胞GJIC功能的调节作用J. 第四军医大学学报, 2007, 28(24): 封2.4 Cronier L, Defamie N, Dupays L, et al. Connexin expression and gap junctional intercellular communication in human first trimester trophoblast J. Mol Hum Reprod, 2002, 8(11):1005-1013.5 Nishimura T, Dunk C, Lu Y, et al. Gap junctions are required for trophoblast proliferation in e