后腹腔镜肾切除手术对免疫功能的影响.doc

后腹腔镜肾切除手术对免疫功能的影响 作者：白冰，徐华敏，母建君，雷弋 【摘要】 目的 使用流式细胞仪技术和ELISA法从T辅助细胞亚群（Th1/Th2）平衡角度和共刺激分子平衡角度评价后腹腔镜肾切除手术对术后免疫功能的影响。方法 择期肾切除患者26例，分别采用后腹腔镜手术和常规开放手术，测定手术前和术后3、24、48h，IL-4和INF-的水平及CD28和CTLA-4的表达。结果 开放手术组术后IL-4水平和CTLA-4表达明显升高，INF-水平和CD28表达下降，INF-/ IL-4比值下降，CD28/ CTLA-4明显下降。腹腔镜组术后各指标均无明显变化，与开放组差异显著。结论 常规开放肾切除手术可造成术后Th1/Th2平衡明显向Th2偏移和共刺激分子失衡，使抗炎反应占优势，造成明显的免疫抑制。而后腹腔镜手术对Th1/Th2平衡和共刺激分子平衡无显著影响，对术后免疫功能影响小。 【关键词】 后腹腔镜；Th1/Th2平衡；共刺激分子；免疫功能 Influence of retroperitoneal laparoscopic nephrectomy on immunological function Abstract Objective To investigate the immunological influences of retroperitoneal laparoscopic renal operation from the view of the balance of Th1 and Th2 cell detected by flow cytometry and costimulatory molecules by ELISA.Methods In optional 26 cases of patients with renal resection,the serum level of IL-4，INF- and CD28，CTLA-4 in 13 patients submitted to retroperitoneal laparoscopic renal operation（RLO） and 13 patients undergoing conventional open operation（COO）were evaluated preoperatively as well as 3，24，48 hours postoperatively.Results The level of INF-，CD28 and the INF-IL-4 ratio decreased significant after the open surgery,but not after RLO.The postoperative level of CTLA-4 and IL-4 increased significant in COO group，but not RLO.The difference of the data in two groups was all significant.Conclusion The present study shows that open，but not retroperitoneal laparoscopic renal surgery is associated with a marked shift in Th1Th2 balance to Th2 and a deregulation of the proinflammatory and anti-inflammatory balance.RLO has fewer influences on Th1Th2 balance and immunologic suppression postoperatively. Key words retroperitoneal laparoscopy；Th1Th2 balance;costimulatory molecules;immunological function 手术对机体免疫的影响主要表现为免疫抑制，免疫抑制易导致机体并发院内感染及肿瘤扩散，因此认识手术对机体免疫的影响极为重要，可预防或调节机体免疫，减少院内感染和肿瘤扩散。目前研究表明导致术后机体免疫抑制的因素有：组织损伤、麻醉和镇痛药物、体温降低、失血和输血、手术前后的焦虑和心理应激、疼痛等。但组织损伤的程度是决定免疫抑制强度和时间的主要因素。后腹腔镜肾切除手术以其创伤小、恢复快等优点近5年在国内逐渐开展，其与普通肾切除手术相比对术后免疫功能的影响国内外未见报道。近来发现，CD4+ 细胞亚群Th1Th2细胞的平衡和共刺激分子的平衡可以反应机体炎症反应和抗炎反应活性，Th1Th2和共刺激分子的平衡失调是导致手术、创伤等应激反应后免疫抑制的重要原因。 1 材料与方法 1.1 病例选择 择期肾切除手术26例，疾病种类为肾肿瘤11例，肾积水致肾功能丧失7例，先天性肾发育不良5例，肾性高血压需行肾切除者3例。可能对免疫有影响的皮质醇增多症及嗜咯细胞瘤未纳入观察。其中后腹腔镜手术13例（A组），对照组为常规开放手术13例（B组）。所有患者均无急性炎症、发热及免疫系统疾患，无激素、免疫抑制剂及其他干扰免疫反应药物服用史。术前一般情况及实验室检查无明显异常（表1）。麻醉方法为全麻，芬太尼、依托咪酯、琥珀酰胆碱快速诱导气管插管，异氟醚-芬太尼-维库溴胺维持麻醉，麻醉用药组间无差异。表1 两组患者一般情况注：与A组比较，P>0.05，*P<0.05 1.2 主要试剂和仪器 APC标记的小鼠抗人IgG1、CD3单克隆抗体（单抗），FITC标记的小鼠抗人IgG1、CD4单抗，PE标记的小鼠抗人IgG1、CD28、CTLA-4均购自美国Ebioscience公司;IL-4和IFN- ELISA试剂盒购自晶美公司。流式细胞仪为美国BD公司产品。PMA、Ionomycin、Brefeldin（BFA）购自美国Sigma公司。溶血剂购自美国BD公司，Fix&Prem破膜剂购自美国Caltag公司。 1.3 实验方法 所有患者于术前、术后3 h、24 h、48 h取外周静脉血经肝素抗凝。外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面CD28、CTLA-4检测：CD28、CTLA-4标记，在试管中加入APC-CD3 20 l、FITC-CD4 20 l及PE-CD28或PE-CTLA-4 20 l，同型对照管中加入同型不相关抗鼠单克隆抗体PE-CD28 20 l；空白对照管加入500 l冷PBS。实验及同型对照管充分混匀，4 暗室避光孵育30 min；加入配制好的溶血剂，室温避光孵育10 min；1000 rmin，离心10 min，去除上清；以冷PBS 10 ml洗涤，再1000 rmin，离心10 min，去除上清，重复该步骤两次；加入PBS 300 l及4多聚甲醛200 l，充分混匀，4 暗室，固定。所有标本在6 h内作流式细胞术检测。使用FACS Vantage，以Coherent氩离子激光器，用Cell Quest 3.1软件获取和分析细胞。以APC-CD3和侧向角（SSC）分别为横坐标和纵坐标的散点图设门，获取CD3 细胞群，调节荧光补偿后，用阴性对照管设定坐标线，获取20 00050 000个细胞。IL-4和IFN-水平的测定:收集保存的上清液标本于15天内解冻，离心除去沉淀物。用酶联免疫法测定IL-4和IFN-。严格按试剂盒说明书操作，并计算结果，以上步骤均由攀枝花中心院检验科协作完成。 1.4 统计学方法 所有数据均以均数标准差（xs）表示。统计处理采用SPSS 11.5软件，组间采用t检验，组内配对t检验，P<0.05为差异有显著性。 2 结果 对照组（B组）术后IFN-水平明显减少，以术后3 h为高峰（为术前39），术后48 h恢复至术前的64，IL-4水平术后则明显增加，以术后24 h最高；腹腔镜组（A组） IFN-、IL-4水平均无明显变化，两组IFN-IL-4比值与IFN-细胞变化一致（表2）。共刺激分子CD28表达在B组术后明显下降（术后3 h为术前的45），腹腔镜对术后CD28表达无影响，B组共刺激分子CTLA-4表达术后24 h最高，A组CD28、CTLA-4表达无明显变化。CD28CTLA-4比值与CD28变化一致（表3）。 表2 两组患者手术前后IFN-、IL-4水平变化注：与术前比较，*P<0.05；组间比较，P<0.05 表3 两组患者手术前后CD3+、CD4+细胞膜表面CD28、CTLA-4表达率变化：与术前比较，*P<0.05；组间比较，P<0.05 3 讨论 近年来发现辅助性T细胞（CD4+、Th细胞）按产生细胞因子的不同可分为Th1、Th2两个亚群，Th1细胞主要产生IL-2、IFN-、TNF-等细胞因子参与细胞免疫，Th2则主要分泌IL-4、IL-5、IL-6等因子调节体液免疫1。研究表明，创伤、手术等外科应激条件会导致Th1、Th2平衡破坏，出现以Th2为优势的克隆转换，Th1型细胞因子分泌受抑制，表现为抗炎性细胞因子占优势的免疫抑制2。本研究中开放手术组患者术后明显表现为IFN-水平减少，并以术后3 h为高峰，而IL-4水平术后明显增加，并持续至术后24 h才开始下降。炎性因子IFN-和抗炎因子IL-4的变化与Th1、Th2细胞基本一致，其中IL-4水平明显以术后24 h为高峰。可见大手术后免疫功能的变化最早出现为Th1细胞减少，其分泌的炎性因子受抑制，其后Th2细胞增加，抗炎因子分泌增多，两者的共同结果是Th1Th2比值的降低，炎性反应抗炎反应失衡，机体处于免疫紊乱状态。持续的免疫抑制是导致术后感染、脓毒血症和恶性细胞扩散的直接原因。 共刺激分子主要有3个家族成员：CD28：B7超家族、TNF：TNFR亚家族和CD2超家族3，其配体中以CD28：CTLA-4B7的研究最多和最为重要4。外界刺激物激发APC形成抗原多肽-MHC复合物，经T细胞受体（TCRCD3）识别后，与共刺激分子共同作用来调整T细胞的免疫应答，包括T细胞的有效活化、增殖进而分泌细胞因子或产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的溶细胞作用5，如没有第二信号参与，TCR与抗原结合将导致T细胞失能或凋亡。共刺激分子主要提供“正性”调节（CD28），部分提供“负性”调节（CTLA-4），正是这种共刺激信号正性和负性调节之间的平衡对保护机体免受外源抗原入侵和阻止自身性免疫性疾病的发展具有重要作用6。有研究显示，外科手术的创伤程度大小直接影响CD28CTLA-4细胞平衡的偏移程度，手术创伤越大，平衡越倾向于CTLA-4，CD28CTLA-4 比值越小。Decker等7比较了腹腔镜胆囊切除术与开腹手术后外周单核细胞在植物凝集素（PhA）刺激下细胞因子的分泌情况，并将CD28CTLA-4比值作为评价手术的指标，结果显示开腹手术患者术后该比值明显低于腹腔镜组。本研究中开放手术组患者术后明显表现为CD3+、CD4+细胞膜表面CD28表达减少，并以术后3 h为高峰。CD3+、CD4+细胞膜表面CTLA-4表达术后明显增加并持续至术后24 h才开始下降。可见在开放手术后，免疫功能的变化为CTLA-4增加，抑制免疫反应其分泌的炎性因子受抑制。而后CD28增加，促进免疫反应，抗炎因子分泌增多。 总之，后腹腔镜肾切除手术与传统开放手术比较可以明显降低术后Th1Th2细胞的偏移程度和影响共刺激分子的平衡，减少抗炎因子和炎性因子的变化程度，有利于术后恢复，应广泛地应用于临床，特别是老年患者和免疫力低下的患者，增加手术的成功率，减少患者的术后并发症。【参考文献】 1 Romagnani S.Lymphokine production by human T cell in disease states.Annu Res Immunol，2004，12：353-360.2 Hensler T，Hecker H，Heeg K，et al.Distinct mechanisms of immunosuppression as a consequence of major surgery.Infect Immunol，1997，65：2283-2289.3 Lassmann H.Hypoxia-like tissue injury as a component of multiple sclerosis lesions.J Neurol Sci，2005，206:187-191.4 Kapoor R，Davies M，Blaker PA，et al.Blockers of sodium and calcium entry protect axons from nitric oxide mediated degeneration.Ann Neurol，2003，53:174-180.5 Craner MJ，Newcombe J，Black JA，et al.Molecular changes in neurons in