大鼠放射性肺损伤过程中乌司他丁的影响.doc

大鼠放射性肺损伤过程中乌司他丁的影响 放射性肺损伤是临床胸部肿瘤放疗、骨髓移植预处理、平时核辐射事故及战时核辐射后严重并发症.研究发现转化生长因子1（TGF1）在放射性肺损伤中起到重要作用1.乌司他丁（天普洛安）是一种广谱的蛋白酶抑制剂，能够抑制多种细胞因子及炎症介质，在临床上已经广泛应用于多个领域，我们通过动物实验建立放射性大鼠肺损伤模型，发现乌司他丁能有效降低TGF1水平，为治疗放射性肺损伤提供了一种新的方法. 1材料和方法 1.1材料健康雌性SD大鼠60只，体质量(18020)g，购于第四军医大学实验动物中心；采用德国西门子公司的6MVX直线加速器；图像采集使用OLYMPUSBX51型号显微镜系统；图像分析使用美国MediaCybernetics公司的ImageProPlus6.0图像分析软件；酶标仪使用美国BioRad公司生产的BioRad450型；TGF1大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒及兔抗大鼠TGF1mAb试剂盒购于美国SantaCruz公司；ABC免疫组化试剂盒购于美国Sigma公司；乌司他丁（天普洛安）购于广东天普生化医药股份有限公司. 1.2方法 1.2.1动物模型制备与实验分组60只雌性SD大鼠随机分为3组（每组20只）：正常对照组（C组）、单纯照射组（R组）、乌司他丁治疗组（U组）.后两组动物经戊巴比妥40mg/kg腹腔麻醉后，以自制的装置固定大鼠，胸部覆以23mm厚蜡块以调整剂量分布，铅屏蔽头部与腹部行直线加速器全胸部照射，单次剂量为20Gy（2Gy/min），距离1m，面积4.5cm4.5cm.U组于照射当日开始以乌司他丁10000U/kg尾静脉注射，而后每天相同剂量静注，共计7d；C，R组同期尾静脉静注同等体积的生理盐水. 1.2.2标本采集于照射后7，15，30，60d每组取5只麻醉后，直接从心脏采血2mL，立刻置入含EDTA的抗凝管中混匀，静置30min后以1500r/min离心15min，留取血浆冻存于-70；将大鼠右侧肺门结扎,气管插管,注入生理盐水4mL,保留3min后吸出,反复3次,收集支气管肺泡灌洗液BALF,将BALF4离心(3000r/min,4min),吸取上清液冻存于-70待测；取右下肺以40g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片. 1.2.3肺组织病理学观察各组大鼠肺组织石蜡切片分别行苏木素伊红（HE）染色观察动物肺组织一般病理学改变，每例实验动物选5张切片，运用OLYMPUSBX51显微图像采集系统100倍下每张切片随机选取10个高倍镜视野观察.ImageProPlus6.0（美国MediaCybernetics公司）医学图像分析软件进行计算机图像分析，测定肺间质面密度等；同法用Masson染色观察肺组织胶原蛋白沉积情况. 1.2.4免疫组化检测TGF1的表达取包埋好切片，按试剂盒说明书步骤进行，兔抗大鼠TGF1多克隆抗体稀释度为（1100），DAB显色，苏木素轻度复染核，光镜下观察.结果以胞质内可见棕红色颗粒者为阳性，以肺泡实质TGF1阳性表达面积作为检测TGF1表达的半定量指标. 1.2.5酶联免疫吸附（ELISA）方法测定TGF1的含量取冻存的血浆及肺泡灌洗液，按照试剂盒说明书步骤严格操作. 统计学处理：采用SPSS12.0统计软件进行数据分析，正态分布数据以xs表示，行单因素方差分析及SNKq检验，P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1肺组织病理学变化HE染色显示C组肺组织结构正常；R组7d肺泡壁增厚，肺毛细血管扩张、充血，少量炎细胞浸润，15d出现局限性炎症浸润灶，30，60d肺水肿明显，局限性肺实变；U组各期炎症、水肿均较R组减轻（图1）.R组在照射后30，60d肺间质面密度逐渐增大(P<0.01)，而U组与同期R组比较明显减小(P<0.01，表1）.Masson染色显示C组可见淡蓝色的基质胶原较少，主要分布在气道及血管外膜.R组7，15d基质胶原与C组相比较稍有增加，30d以后血管外膜及肺泡间隔 胶原纤维增多，U组与R组同期相比胶原纤维减少（图2）.表1不同组间放射性肺损伤肺间质面密度的变化 2.2TGF1免疫组化检测C组肺组织TGF1在肺泡间隔、细支气管平滑肌、血管平滑肌、血管内皮、血管周围仅弱表达或不表达，阳性面积少；R组在30,60d时上述部位明显比C组表达增强，并出现肺泡上皮细胞、肺间质巨噬细胞强阳性表达，阳性面积随之明显增加（P<0.01），U组表达部位与C组相似，阳性面积较R组明显减少（P<0.01，图3，表2）. A：正常对照组；B：单纯照射组；C：乌司他丁治疗组. 图3各组大鼠肺组织TGF1免疫组化染色（30d）400表2大鼠肺组织TGF1免疫组化阳性面积变化(n=5，m2，xs)组别照射后（d）7153060C22132241272382322919R3172952839b96549b1367113bU2432237931c58626d76359dbP<0.01vsC；cP<0.05，dP<0.01vsR.C:对照组;R:单纯照射组;U:乌司他丁治疗组. 2.3TGF1ELISA检测随照射后时间延长，R组血清TGF1水平逐渐升高，30d时较前增加趋势明显，60d时达高峰，较C组相比较具有统计学差异性，同时U组TGF1水平也缓慢增加，但较R组减少（P<0.01）；肺泡灌洗液中TGF1水平和血清基本一致，不同的是30d时达到高峰后开始下降（表3）.表3放射性肺损伤血清及肺泡灌洗液内TGF1水平的变化 3讨论 放射性肺损伤的发生是多因素引起的，既牵涉到射线所损伤的多个靶细胞，又涉及到这些靶细胞和其相关细胞所释放出来的多种细胞因子2；晚期则随着组织的修复、肉芽的生长逐渐出现以纤维细胞增生、基质胶原化为主的肺间质纤维化的改变，从而导致患者呼吸衰竭，成为主要死因之一.目前对放射性肺损伤的治疗，有针对早期炎症阶段的糖皮质激素、非甾体类消炎药及辅助r干扰素和减轻肺损伤的药物.上述治疗大多以减轻早期炎症，后期仍有大量的肺间质纤维化形成，治疗效果不能令人满意. TGF1是人体多种上皮起源细胞的生长调节因子，在细胞的生长、分化及细胞外基质沉积和机体免疫反应方面具有广泛的生物学效应3，被公认为与放射性肺纤维化发生和形成关系最为密切的介导因子，在放射性肺炎的发生和维持过程中占有重要地位4-5.通过HE和Masson染色观察到照射后大鼠肺泡II型上皮细胞、血管内皮等细胞损伤，逐渐出现肺水肿以及肺泡炎症等，放射性肺炎症程度逐渐加重，这与照射后肺组织中、血清、肺泡灌洗液的TGF1水平变化基本一致，说明TGF1在放射性肺损伤发生、发展过程中的重要作用.而乌司他丁治疗组与R组相比，大鼠肺水肿及肺泡炎症等明显减轻，另