实验性糖尿病大鼠早期视网膜电图的变化.doc

实验性糖尿病大鼠早期视网膜电图的变化 作者：代海滨，常耀明，张作明，丁振强，李金声 【关键词】 链脲佐菌素 【Abstract】AIM: To observe the changes of electroretinogram of SpragueDawley rats with earlystage (within 5 weeks) diabetes. METHODS: According to standard program recommended by International Society for Clinical Visual Electrophysiology, we recorded the rodresponse, maxresponse, oscillatory potentials (OPs), photopic electroretinograph (photERG) and 20 Hz flicker response in earlystage diabetic rats induced by streptozotocin (STZ) and agematched control ones. RESULTS: Before and at the first week after onset of diabetes, the ERG of diabetic rats did not differ significantly from that of control ones but at the second and fifth week, the implicit times of b wave of rodresponse, b wave of maxresponse, O2 wave of OPs and b wave of photERG of diabetic rats were respectively prolonged significantly compared to those of control ones. However, no significant difference was found between the ERG amplitudes of diabetic rats and those of control ones. CONCLUSION: The observations indicate that the implicit times of b wave of rodresponse, b wave of maxresponse, O2 wave of OPs and b wave of photERG are respectively prolonged significantly in earlystage diabetic rats, which can be used as indicators inspecting the early development of diabetic retinopathy. 【Keywords】 electroretinography; diabetic retinopathy; streptozotocin; rats 【摘要】 目的： 观察实验性糖尿病早期对大鼠视网膜电图的影响. 方法： 链脲佐菌素诱导的糖尿病组大鼠和日龄相匹配的对照组正常大鼠，采用国际临床视觉电生理学会推荐的标准化方案，在糖尿病早期阶段（5 wk内）对其进行杆细胞反应、最大反应、振荡电位、明适应视网膜电图和20 Hz闪烁反应5个项目的检查. 结果： 在诱导糖尿病前和建模后1 wk时，糖尿病组大鼠与对照组相比未发现视网膜电图的异常；在建模后2 wk和5 wk时，糖尿病组杆细胞反应b波、最大反应 b波、振荡电位O2波和明适应视网膜电图b波的潜伏期都比对照组相应各波的潜伏期显著延长；两组大鼠各波的幅值始终未发现显著改变. 结论： 糖尿病大鼠在早期阶段杆细胞反应b波、最大反应b波、振荡电位O2波和明适应视网膜电图b波的潜伏期显著延长，这有可能成为监测糖尿病视网膜病变早期发展的指标. 【关键词】 视网膜电描记术；糖尿病视网膜病；链脲佐菌素；大鼠 0引言 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者的普遍性并发症,是造成视力丧失和致盲的主要原因1. 然而，糖尿病导致视网膜病变的确切病理机制仍未完全阐明. 糖尿病患者视网膜微血管的异常变化通常被作为DR确诊的早期征象，这些异常变化包括毛细血管周细胞选择性丧失、基底膜增厚、微血管瘤形成和终端毛细血管闭锁等2. 伴随微血管异常引起血视网膜屏障的破坏，又会造成DR患者发生视网膜神经组织黄斑水肿1. 在各种糖尿病动物模型研究中，与人类DR病理变化类似的血管并发症得到成功证实3-5. 但是，这些可视性病理变化一般在建模成功后几个月才能观察到. 在近年的研究中，越来越多的实验支持在糖尿病模型建模成功后早期就发生了视网膜血管内皮的损伤6,7和神经组织代谢异常8. 视觉电生理检查是一种无创性的客观检查方法，能够反映被检者的视觉功能情况，被广泛应用于临床诊断和科学研究中. 为确定在糖尿病模型建模成功后早期，伴随血管和神经组织代谢异常，是否会发生视觉电生理检查的异常，我们采用视觉电生理检查技术对糖尿病大鼠视网膜电图（electroretinogram, ERG）的早期变化进行了观察. 1材料和方法 1.1材料 封闭群健康成年雄性SD大鼠14只（第四军医大学实验动物中心提供），约89 wk龄，体质量为230250 g，外眼和检眼镜检查屈光间质清晰. 饲养于12 h 明暗交替，室温1823环境，喂饲标准大鼠饲料，食水不限. 链脲佐菌素（streptozotocin, STZ, 美国Sigma公司），微量快速血糖仪One Touch 型及其专用一次性血糖试纸（美国Lifescan公司），一次性尿糖试纸（广州市越秀东方新科技研究所研制）. 1.2方法 1.2.1动物分组将14只雄性SD大鼠适应性饲养1 wk后，随机等分为两组，正常对照组7只，糖尿病组7只. 分别于建模前（0 wk），建模后1，2和5 wk共4个时间点监测每组大鼠的体质量、血糖、尿糖和ERG. 1.2.2动物模型的建立将糖尿病组大鼠禁食水12 h后，ip 10 g/L STZ溶液( STZ溶解于pH 值4.4，浓度为0.01 mol/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液)，剂量为50 mg/kg . 按照ARahim等9和Stevens等10建模标准，注射STZ后2 d，在大鼠尾静脉采血，用One Touch 型血糖仪检测血糖浓度，凡血糖浓度> 11 mmol/L，尿糖()以上，出现多食、多饮、多尿症状的大鼠视为建模成功的糖尿病大鼠. 对照组大鼠ip 等体积的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（pH 值4.4，浓度为0.01 mol/L）. 在各时间点监测糖尿病大鼠的血糖，凡血糖 <11mmol/L 的大鼠从组中剔除. 1.2.3ERG检查暗适应3 h以上的大鼠，ip速眠新注射液（又名846 合剂，长春解放军农牧大学兽医研究所制）麻醉，剂量0.8 mL/kg. 将麻醉状态的大鼠固定于有机玻璃实验台上，左眼滴5 g/L的托品酰胺散瞳，尾部、左侧颊部和左眼角膜表面分别安放接地电极、参考电极和记录电极，并在角膜表面滴10 g/L的甲基纤维素. 参考电极和接地电极为不锈钢针制成，记录电极为 0.2 mm银氯化银制成的环形电极. 采用RETIport 系统（Roland Consult, 德国），进行杆细胞反应（rodresponse）、最大反应（maxresponse）、振荡电位（oscillatory potentials，OPs）、明适应视网膜电图（photopic electroretinograph，photERG）和20 Hz闪烁反应（20 Hzflicker response）记录. 杆细胞反应光强为0.011 cd・s/m2；photERG, OPs和20 Hz闪烁反应光强为3.5 cd・s/m2. 记录ERG的通频带为1300 Hz，OPs为100300 Hz. photERG和20 Hz闪烁反应之前进行10 min的明适应（明适应光强37 cd/m2）. 观察ERG a波，b波，OPs O2波和20 Hz闪烁反应 P1波潜伏期和幅值的变化. 统计学处理： 实验结束后，应用RETIport系统进行波形潜伏期和幅值的测量. 数据用xs表示，糖尿病组与对照组ERG各波潜伏期和幅值的比较在统计软件SPSS 11.0下进行析因设计的方差分析，P<0.01为有统计学差异. 2结果 2.1大鼠的体质量对照组大鼠每日饮水量、尿量正常，毛色光滑、柔顺，体质量随周龄增加而明显增加（Tab 1）；糖尿病组大鼠每日饮水量、尿量明显多于对照组，毛色灰暗,且体质量随周龄不增加.表1对照组和糖尿病组大鼠的体质量（略） 2.2大鼠的血糖和尿糖对照组大鼠的血糖始终处于大鼠血糖值正常范围2.87.5 mmol/L11，而糖尿病组大鼠的血糖值处于模型要求9,10的标准之上（Tab 2）. 对照组大鼠的尿糖检测，各时间点都为阴性（-）；而糖尿病组大鼠的尿糖，各时间点都呈强阳性（）. 表2对照组和糖尿病组大鼠的血糖（略） 2.3ERG检查糖尿病组大鼠杆细胞反应,最大反应,OPs, PhotERG, 20 Hz闪烁反应5项检查各波的潜伏期和幅值在0 wk时和建模后1 wk时分别与对照组0 wk和1 wk时相比，均无明显差异；但是，在2 wk和5 wk时，糖尿病组杆细胞反应b波的潜伏期、最大反应b波的潜伏期、OPs O2波的潜伏期、PhotERG b波的潜伏期分别与对照组相比，明显延长（P<0.01, Tab 3），然而，杆细胞反应a波的潜伏期及幅值和b波的幅值、最大反应a波的潜伏期及幅值和 b波的幅值、OPs O2波的幅值、photERG a波的潜伏期及幅值和b波幅值、20 Hz闪烁反应P1波的潜伏期及幅值分别与对照组相比，均无明显差异（Tab 3）.表3杆细胞反应b波、最大反应b波、OPs O2波、PhotERG b波的潜伏期（略） 3讨论 视觉电生理检查是反映视网膜各个层次细胞功能状态的客观检查. ERG 的a 波起源于视网膜光感受器层，是一种超极化动作电位，反映光感受器细胞的生物电活动12. ERG b波一般认为起源于视网膜双极细胞13，但也有人认为起源于mller 细胞，其变化在一定的特性方面仍反映视网膜内核层细胞(主要是双极细胞)的电活动, 在视网膜功能的诊断上是一个可靠而灵敏的客观指标；OPs波是附加在a 波和b 波上的一系列节律性的低振幅电位,可能起源于无长突细胞或视网膜抑制性反馈回路中,其状态对视网膜血液循环功能的变化比较敏感；明适应ERG及闪烁ERG与视网膜锥细胞的功能和其传导通路相关14. EGR潜伏期的长短主要反映神经传导通路的功能状态，而振幅的高低主要反映视网膜各层细胞的功能状态. ERG 各种成分的异常变化与视网膜的病理改变密切相关. 近年关于 DR的实验研究中，Joussen 等6发现链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠在1 wk就出现了视网膜血管内皮细胞的损伤和死亡；Yamashiro 等7发现糖尿病大鼠在2 wk出现了视网膜微血管系统血小板微血栓的聚集和内皮细胞的死亡；Park 等15发现糖尿病大鼠在1 wk出现了视网膜水平细胞突触后突起的变性，在4 wk出现了节细胞的坏死；Barber 等8发现糖尿病大鼠在1 mo时视网膜平铺片TUNEL法标记凋亡细胞的数量比正常鼠增加10倍以上. 这些研究把以前糖尿病模型的研究时间点3-5大大提前，为探索人类糖尿病的早期预防和治疗起了十分重要的提示作用. 这些病理变化的出现预示着视网膜电生理功能不可避免地出现改变. Li 等16发现糖尿病大鼠最早在2 wk时ERG的振幅就比对照组减少，且糖尿病对ERG b波的影响大于对a波的影响. 本实验中，我们观察到糖尿病大鼠在早期阶段出现了视觉电生理功能的改变，表现为视网膜电图的潜伏期变化显著，潜伏期在2 wk以后比对照组明显延长，但始终未出现振幅的改变. 与Li 等16的实验相比，我们的实验仅发现 ERG 潜伏期有变化，没有发现ERG 的振幅有变化，推测可能由于我们实验模型的血糖值要求较低，短期内对视网膜代谢的损坏程度轻微，因而没有检测到ERG振幅发生变化. 但是，我们和Li等16的研究都支持糖尿病大鼠在早期确实发生了视觉电生理功能的改变，这些提示我们应当把ERG检查作为监测DR早期发展的有效指标. DR目前仍无特效药物治疗，临床常用的定期眼底荧光血管造影也只能监测DR晚期是否造成了大面积毛细血管闭塞，因此对DR的早期诊断和对症治疗以延缓视觉功能的渐进性损失显得更为重要，糖尿病早期ERG潜伏期的延长有可能成为监测DR早期发展的指标. 【参考文献】 1 Frank RN. Diabetic retinopathy J. N Engl J Med, 2004; 350(1): 48-58. 2 Garner A. Histopathology of diabetic retinopathy in man J. Eye, 1993; 7(2): 250-253. 3 Sima AA, Chakrabarti S, GarciaSalinas R, et al. The BB rat: An authentic model of human diabetic retinopathy J. Curr Eye Res, 1985; 4(10): 1087-1092. 4 Robinson WG, Mc Caleb ML, Feld LG, et al. Degenerated intramural pericytes (ghost cells) in the retinal capillaries of diabetic rats J. Curr Eye Res, 1991; 10(4): 339-350. 5 Robison WG, Laver NM, Jacot JL, et al. Efficacy of treatment after measurable diabeticlike retinopathy in galactosefed rats J. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997; 38(6): 1066-1073. 6 Joussen AM, Murata T, Tsujikawa A, et al. Leukocytemediated endothelial cell injury and death in the diabetic retina J. Am J Pathol, 2001; 158(1): 147-152. 7 Yamashiro K, Tsujikawa A, Ishida S, et al. Platelets accumulate in the diabetic retinal vasculature following endothelial death and suppress bloodretinal barrier breakdown J. Am J Pathol, 2003;163(1):253-259. 8 Barber AJ, Lieth E, Khin SA, et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulinJ. J Clin Invest, 1998; 102(4): 783-791. 9 ARahim YI, Beyer KH Jr, Vesell ES. Studies on pyrazinoylguanidine. 1. Characterization of metabolic effects in diabetic rats J. Pharmacology, 1996; 52(3): 135-144. 10 Stevens MJ, Obrosova I, Cao X, et al. Effects of DLalphalipoic acid on peripheral nerve conduction, blood flow, energy metabolism, and oxidative stress in experimental diabetic neuropathy J. Dia