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益气养阴、消癥通络中药对大鼠肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的影响作者：张江华 陈志强 孙玉凤1 赵雯红 王月华 王会青 李玉梅【摘要】 目的 探讨益气养阴、消癥通络中药药物血清对大鼠系膜细胞细胞外基质(ECM)不同成分的抑制作用。方法 以体外培养大鼠肾小球系膜细胞及血清药理学方法为基础,采用酶联免疫吸附试验检测ECM中纤维连接蛋白(FN)、层黏连蛋白(LN)、型胶原(Col IV)的含量。结果 FN、Col 的含量均增加，而益气养阴、消癥通络中药对其具有明显抑制作用。结论 益气养阴、消癥通络药物能够减少ECM的积聚，可能是其防治肾小球硬化的机制之一。 【关键词】 系膜细胞;益气养阴、消癥通络;层黏连蛋白;纤维连接蛋白;型胶原;细胞外基质【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of herb of supplement qi and nourish yin eliminating mass and dredge nels and collaterals on the mesangial cells (MCs) secreting extracellular matrix (ECM). Methods Based on the method of culturing MCs in vitro and serum pharmacology, the contents of fibronectin (FN), laminin (LN) and collagen (Col ) in ECM were detected by ELISA.Results The contents of FN, LN, Col in ECM were all increased, while inhibited by herb of supplement qi and nourish yin eliminating mass and dredge nels and collaterals significantly. Conclusions Herb of supplement qi and nourish yin eliminating mass and dredge nels and collaterals can decrease the accumulation of ECM, which may be one of the mechanisms of preventing glomerulosclerosis.【Key words】 Mesangial cells;Supplement qi and nourish yin eliminating mass and dredge nels and collaterals;Laminin;Fibronectin;Collagen ;Extracellular matrix 糖尿病肾病(DN)基本病理改变为早期肾小球毛细血管球肥大，基底膜(GBM)增厚，细胞外基质(ECM)进行性积聚。ECM的产生增加和(或)降解减少被认为是ECM积聚的主要原因。系膜细胞产生ECM的能力最强。ECM的主要成分是层黏连蛋白(LN),胶原纤维(Col)、纤维连接蛋白(FN)及蛋白多糖，因此，LN和FN、Col可作为研究DN早期病理变化的重要指征1。本研究主要针对原代培养的大鼠系膜细胞ECM进行检测，探讨消癥通络中药对DN的保护作用，为DN临床治疗提供依据。1 材料与方法1.1 材料 益气养阴、消癥通络中药(由黄芪、积雪草、丹参、茯苓、熟地、地龙、水蛭、鳖甲、大黄、砂仁等组成，水煎、过滤、浓缩按成人剂量的15倍制成含生药0.7 g/ml)，由河北医科大学附属河北省中医药中药房提供。厄贝沙坦片(安博维)，150 mg/片，用时按成人用量15倍用水溶解，配制成含药浓度为1.88 g/ml药液，杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产，批号0809155。血管紧张素(Ang)、胰蛋白酶、型胶原酶、Hepes(美国Sigma公司)，RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(澳大利亚PAA公司)，EDTA(美国Amresco公司)。318MC型酶标仪(上海三科仪器有限公司);低速离心机(北京医用离心机厂)，CO2恒温培养箱(日本三洋电机株式会社);倒置显微镜(日本Olympus公司);超净工作台(北京半导体设备厂)。1.2 方法1.2.1 实验血清的制备 健康SD大鼠36只,SPF级,体重180220 g，雌雄兼用，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号：905042。将动物随机分为3组，正常组、中药组及厄贝沙坦组。正常组给予相应剂量的蒸馏水，其余各组按每次4 ml灌胃给药，每日2次，连续3 d。最后1 d 2次给药时间间隔为2 h，于末次给药后12 h，用3%戊巴比妥(1.5 ml/kg体重)腹腔麻醉大鼠，股动脉取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，56水浴中灭活30 min，0.22 m微孔滤膜过滤，-20冷藏备用。1.2.2 实验分组 分为正常组：RPMII1640培养液中含5%胎牛血清+5%正常大鼠血清;高糖组：培养液含有D葡萄糖浓度25 mmol/L+5%胎牛血清+5%正常大鼠血清;高糖+Ang组：培养液含有D葡萄糖浓度25 mmol/L+5%胎牛血清+5%正常大鼠血清+Ang10-6 mol/L;厄贝沙坦组：培养液含有D葡萄糖浓度25 mmol/L+5%胎牛血清+Ang 10-6 mol/L+5%厄贝沙坦血清;中药组：培养液含有D葡萄糖浓度25 mmol/L+5%胎牛血清+Ang 10-6 mol/L+5%中药血清。1.2.3 系膜细胞的培养 正常Wistar大鼠,体重75100 g,断颈处死后,清洁取肾,分离皮质、髓质。皮质被剪成碎屑,依次通过100,140,200目筛网,收集肾小球,型胶原酶溶液消化,当细胞分散成单个时,用胎牛血清终止消化,加适量培养基吹匀接种于含20%的胎牛血清、10万U/L青霉素、100 g/L链霉素的RPMI1640培养基中,5%CO2、37培养箱培养。当细胞长至90%融合时,用0.25%胰蛋白酶消化传代。第57代细胞用于实验。1.2.4 系膜细胞鉴定 形态学及功能鉴定。1.2.5 系膜细胞上清的收集 取传代培养的系膜细胞，吸去培养液，用DHanks液洗涤培养瓶2次，然后加0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA 4 ml，放入培养箱中，37消化数分钟，之后加入含20% FCS 1640液5 ml终止消化，4、1 000 r/min,离心5 min，弃去上清，加入培养液以1104/孔接种于48孔培养板中，常规培养24 h，使细胞贴壁。更换无血清1640培养液，继续培养24 h使细胞同步于G0/G1期，吸弃培养板内培养液，按实验分组加入各自不同条件培养液，继续培养72 h，终止培养，收集培养上清液，-80低温冰箱保存待测。1.2.6 培养的上清FN、LN、Col的含量检测 采用ELISA法检测，严格按说明书操作步骤进行。1.3 统计学分析 数据以xs表示,用SPSS 13.0统计软件进行多组数据间比较用方差分析。2 结 果2.1 系膜细胞的鉴定 倒置显微镜下观察其典型的形态学特征:培养18 d后,贴壁的肾小球周围长出梭形或星形特点的细胞,随着时间延长,细胞铺满瓶底，见图1;功能鉴定：在细胞上滴加血管内皮素后,细胞呈强烈的收缩反应,由梭形、星形或不规则形变为圆形;超微结构观察:透射电镜下GMC也成星形或梭形,胞质内有少量分布的线粒体、粗面内质网、高尔基复合体外,还有最为特征性的是位于胞膜下和细胞突起向内的微丝结构,核居中央,多呈圆形或卵圆形,核染色质较为稀疏，见图2。2.2 各组细胞上清液中LN、FN及Col的表达 高糖组系膜细胞分泌FN、LN和Col量明显增加，与正常组比较有非常显著性差异(P0.01);与高糖组相比，高糖+Ang组系膜细胞分泌FN、LN和Col量显著增加(P0.01);厄贝沙坦组与中药组均能明显降低FN、LN和Col的分泌量(P0.05，P0.01)，与高糖+Ang组比较有非常显著性差异(P0.05)。表1 LN、FN及Col含量的比较与正常组比较：1)P0.05，2)P0.01;与高糖组比较：3)P0.05，4)P0.01;与高糖+Ang组比较：5)P0.013 讨 论肾小球系膜细胞过度增殖引起ECM合成的增加，是肾小球硬化发生、发展的重要机制，亦是造成肾脏功能进行性损害的重要环节2。高糖活化系膜细胞内的某些信号通路,如Ang以及炎症细胞因子等的活化,导致FN、LN和Col mRNA转录增加、分泌增多以及肾小球系膜细胞增殖,最终导致间质的纤维化肾小球的肥大,加速了DN的发生与发展。Ang为系膜细胞外基质合成的强诱导剂，主要是导致系膜细胞增殖肥大，促使ECM合成、沉积，最终促进DN的发展，发生肾脏纤维化3。故本研究采用高糖环境下，Ang诱导系膜细胞增殖。目前认为，DN为本虚标实之证，以脾肾及气血阴阳之虚为本,气滞、湿阻、血瘀、痰聚为标,气阴两虚是糖尿病肾病发病基础，消渴病日久不愈，伤阴耗气。益气养阴、化瘀通络中药是陈志强教授针对临床上DN病程中气阴两虚，血瘀浊聚基本病机而确立的复方中药，其中黄芪益气，走而不守，配伍茯苓、砂仁、熟地，气阴兼顾、健脾益气、补肾敛精、利水消肿;水蛭性缓则气血不伤，善入则坚积易破，配伍地龙、鳖甲，活血祛瘀，散结软坚;大黄同煎，可通腑泄热，荡涤积滞，使浊邪从下窍而出;与积雪草同用,有清热利湿、消肿解毒之功效。诸药合用，共奏补脾益肾，益气养阴，活血化瘀，利水泄浊之功，使扶正不留邪，祛邪不伤正。现代药理研究表明，益气养阴、消癥通络中药能改善肾小球滤过屏障，减轻通透性蛋白尿，抑制血栓形成,降低血小板黏附率,改善DN血液流变学,延缓DN发展,保护肾功能37。本研究说明益气养阴、消癥通络中药与厄贝沙坦均能阻滞Ang的损伤,减轻ECM的积聚，对于进一步研究DN时肾小球硬化和肾纤维化的治疗具有重要意义。【参考文献】 1 周必发,张莹雯.当归补血汤对高糖条件下系膜细胞增殖及细胞外基质的影响J.武汉大学学报(医学版),2008;29(4):47681.2 孙 奕,朱冬燕,张明华,等.延肾口服液对人肾小球系膜细胞增殖及分泌FN、LN、c的影响J.武警医学院学报,2009;18(6):47780.3 Ohishi T,Saito H,Tsusaka K,et al.Albuminuria and renal insufficiency prevalence guides population screening:results from the NHANESJ. Kidney Int,2006;21(2):14758.4 王光