柽柳水提物对小鼠脾细胞及肿瘤细胞增殖反应的影响.doc

柽柳水提物对小鼠脾细胞及肿瘤细胞增殖反应的影响 作者：梁文杰，王志超，马国平【摘要】 目的探讨中药柽柳水提物(Tamarix chinensis Lour.extract with water，TEW)的生物学活性。方法采用MTT法检测了TEW对小鼠脾细胞及肿瘤细胞增殖的作用。结果无论有无ConA诱导，TEW均可刺激小鼠脾细胞增殖;高浓度的TEW对肿瘤细胞K562及TE13有一定抑制作用，而对于SK-OV3，BGC823及BxPC-3，PANC-1等基本无抑制作用。结论TEW对小鼠脾细胞具有丝裂原样作用，但对肿瘤细胞的抑制作用甚微。 【关键词】 柽柳; 小鼠脾细胞; 肿瘤细胞柽柳又名西河柳，为柽柳科植物柽柳Tamarix chinensis Lour.的嫩枝叶。药性辛平，归肺、胃、心经。有发表透疹，祛风除湿之功效，应用于麻疹不透，风疹瘙痒及风湿痹痛等1，还具有抗菌抗炎、止咳祛痰及抗组胺等作用2。但关于柽柳的免疫学及对肿瘤细胞的作用报道甚少，本文就柽柳水提物(TEW)对小鼠脾细胞及肿瘤细胞增殖反应的影响进行报道。1 材料与仪器1.1 动物体质量1822 g的昆明小鼠，购于河北医科大学实验动物中心。1.2 肿瘤细胞株人红白血病细胞株K562，人胃癌细胞株BGC823，人食管癌细胞株TE13，人卵巢癌细胞株SK-OV3及人胰腺癌细胞株BxPC-3、PANC-1等，由河北医科大学第四医院科研中心提供。1.3 仪器及试剂美国SHELDON公司TC2323型CO2培养箱;日本OLYMPUS LH50A型倒置相差显微镜;奥地利Anthos公司HT2型酶标仪等。四氮唑盐(MTT)试剂及ConA购自Sigma公司，SDS为Biotec公司产品，RPMI1640为GIBCO公司产品。1.4 药物提取柽柳购自河北安国，产地辽宁，经河北医科大学药学院鉴定。取柽柳干品5 g,加蒸馏水100 ml浸泡过夜，100水浴1 h，滤纸过滤除去不溶物质，用无菌滤器除菌，用旋转蒸发仪测定溶质含量，调节浓度为10 mg/ml，作为TEW于4冰箱保存备用。2 方法2.1 小鼠脾淋巴细胞增殖实验常规制备小鼠脾细胞悬液，调整细胞浓度为5106/ml，将小鼠脾细胞悬液100 l /孔接种于96孔培养板，而后分别加入阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照ConA及不同浓度TEW，各设3个复孔。将培养板置于饱和湿度、37 ，5 % CO2培养箱中培养48 h，加入5 mg/ml MTT 10 l，再培养8 h，离心弃上清，每孔加入15 % SDS 100 l，过夜。次日用酶标仪检测各孔吸光度(OD)值，测定波长=570 nm，参考波长=630 nm。并计算增殖指数(PI)。其计算公式为：PI=实验组OD值/ 对照组OD值100%。2.2 体外抑瘤实验将肿瘤细胞株悬液每孔100 l(含1104个细胞)接种于96孔培养板，分别加入阴性对照PBS、阳性对照200 g/ml的顺铂(DDP)和250 g/ml的羟基喜树碱(HCPT)以及不同浓度TEW各10 l，各设3个复孔。置于饱和湿度、37、5 % CO2培养箱中培养72 h，于培养结束前4 h，各孔加5 mg/ml MTT10 l，培养结束后，弃上清，每孔加15 % SDS100 l，过夜。次日用酶标仪检测各OD值，测定波长=570 nm，参考波长=630 nm，并计算抑制率(CI)，CI=(对照组OD值-实验组OD值)/ 对照组OD值100%。CI30%为敏感。2.3 统计学处理数据用s表示。两组间数据用t检验，多组间数据用单因素方差分析。应用The SAS system 6.12统计软件计算。所有实验结果均重复3次。3 结果3.1 柽柳水提物TEW对小鼠脾淋巴细胞的作用在体外培养的小鼠脾淋巴细胞培养液中加入31.3500 g/ml浓度的TEW可刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，镜下观察可见细胞体积变大，数量增多，并分裂成簇，见图1，而对照组无此变化。加入MTT后，可见蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)远较对照组为多，见图2。说明TEW本身具有丝裂原样作用。并且TEW对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应亦有较明显的促进作用，提示TEW和ConA的作用具有一定的协同性。见图3。A.未处理细胞;B.125 g/ml的TEW处理48 h细胞图1 小鼠脾细胞形态(200)A.阴性对照组;B.125 g/ml的TEW处理48 h实验组图2 甲瓒结晶形态(200)3.2 TEW对肿瘤细胞增殖作用的影响表2结果显示，与阴性对照比较，250500 g/ml高浓度的TEW对血液细胞源性细胞株K562及上皮细胞源性细胞株TE13具有一定的抑制作用，但随着药物浓度的下降，抑制作用迅速下降、消失，抑制率甚至出现负值。而对于人卵巢癌细胞株SK-OV3、人胃癌细胞株BGC823及人胰腺癌细胞株BxPC-3、PANC-1等基本无抑制作用。见图4。说明TEW对肿瘤细胞的抑制作用甚微。与阳性对照比较，*P<0.01图3 TEW对小鼠脾细胞增殖反应的影响与阳性对照比较，*P<0.01图4 TEW对肿瘤细胞增殖反应的影响4 讨论柽柳是临床常用中药，主要用于解表发散风寒，但其免疫学作用尚未见报道。我们在抗肿瘤中药筛选过程中，发现TEW在体外无论有无有丝分裂原ConA均可促进小鼠脾淋巴细胞增殖，提示TEW本身具有丝裂原样作用，可直接启动淋巴细胞表面受体活化，同时亦能协同有丝分裂原ConA诱导的脾淋巴细胞增殖，TEW很可能可改善机体免疫力。植物多糖具有广泛的生物学活性，特别对机体免疫系统的作用备受关注，如北豆根多糖可促进小鼠脾淋巴细胞增殖3，而TEW中是否是多糖成分发挥免疫调节作用，尚需对有效成分进一步分离和鉴定。柽柳提取物可望成为有前景的生物制剂。以往关于柽柳对于肿瘤细胞的作用亦罕有报道，民间柽柳用于治疗癌症4。王斌等5对柽柳抗肿瘤化学成分进行分离和鉴定，发现西河柳萜类化合物、和对人肺癌细胞A-549，化合物对人肝癌细胞株BEL-7402在50 g/ml下，显示有意义的细胞毒活性。本实验表明TEW体外对肿瘤细胞的抑制作用甚微，仅高浓度的TEW对少数肿瘤细胞株有一定的抑制作用，且尚不能排除高浓度而致的高渗透压对于肿瘤细胞的影响。但本实验并不否定柽柳的某些成分对于肿瘤细胞的作用。综上所述，TEW体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有促进作用，但对于肿瘤细胞的直接抑制作用甚微。这使其作为免疫调节药物的开发成为可能，其有效成分有待进一步分离、纯化和鉴定。【参考文献】 1 高学敏.中药学M.北京：中国中医药出版社，2007：68.2 董昆山，王秀琴，董一凡.现代临床中药学M.北京：中国中医药出版社，1998：167.3 梁文杰，刘东青，单保恩，等.