解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏的保护作用.doc

解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏的保护作用 作者：陈益山 曹文富 焦颖华 肖柯【摘要】 目的 观察中药复方解聚复肾宁(JJFSN)对糖尿病 (DM)大鼠肾脏的保护作用。方法 建立链脲佐菌素（STZ）诱导的DM大鼠模型，将成模大鼠随机分成4组：模型组、JJFSN组、厄贝沙坦组、JJFSN+厄贝沙坦组，并设正常对照组。各组大鼠采用相应的干预措施处理12 w。常规方法检测各组大鼠尿白蛋白排泄率(UAER)等指标，免疫组化法检测肾血管内皮生长因子（VEGF）和骨形成蛋白7（BMP7）表达，Western印迹检测肾组织血小板衍化生长因子B（PDGFB）的表达，透射电镜观察肾脏超微结构。结果 模型组大鼠除肾BMP7表达显著减少外，其余指标均显著增高,肾脏超微结构改变明显；JJFSN组、厄贝沙坦组和JJFSN+厄贝沙坦组除肾BMP7显著高于模型组(P0.05)外，其余指标均显著低于模型组(P0.05)，肾脏超微结构改变明显改善；JJFSN+厄贝沙坦组各项指标改善明显优于模型组、JJFSN组和厄贝沙坦组(P0.05)，但未达到正常对照组水平。结论 JJFSN对DM大鼠肾脏有明显保护作用。 【关键词】 解聚复肾宁；糖尿病【Abstract】 Objective To investigate the effect of Jiejufushenning（JJFSN） on renal protection in diabetic nephropathy rats. Methods The diabetic SD rats induced by STZ were divided into 4 groups: model, JJFSN, irbesartan and JJFSN combined with irbesartan and control group. Rats in each group were respectively treated for 12 weeks by the appropriate intervention methods. The relative urinary albumin excretion rate (UAER), and other indicators were detected by routine analysis methods, and VEGF and BMP7 in renal tissue were detected by immunohistochemical techniques, and PDGFB in renal tissue was detected by Western blot, and ultramicrostructure of kidney was observed by transmission electron microscope. Results In addition to renal cortex BMP7 expression of a significant reduction, the other indicators were significantly higher in diabetic rats. The ultramicrostructure of kidney was noticeably changed. While the above indexes in JJFSN, irbesartan and JJFSN combined with irbesartan groups were significantly better than in diabetic control group (P0.05), and ultramicrostructure of kidney changed was improved, and the improvement of all indexes in JJFSN combined with irbesartan group was most significant (P0.05). Conclusions Protective effect of JJFSN on diabetic nephropathy in rats is obvious. 【Key words】 Jiejufushenning; Diabetes糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要并发症之一。目前，现代医学除积极控制血糖和血压、限制蛋白质摄入、应用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂外，尚缺乏确实有效的方法。本实验旨在观察解聚复肾宁(JJFSN)对DN大鼠肾脏的保护作用。1 材料与方法1.1 药物和试剂 JJFSN由黄芪、生地黄、黄连、黄芩、丹参、葛根等十几味组成，原药购自重庆桐君阁药房，经重庆医科大学中医学院中药研究室鉴定并制备成浓缩煎剂，含生药2 g/ml；厄贝沙坦为杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司产品，批号：0703116；链脲佐菌素(STZ)为ALEXIS公司产品，批号：L18034；血管内皮生长因子（VEGF）兔多克隆抗体（BA0407）、骨形成蛋白7（BMP7）兔多克隆抗体（批号：BA0665）、血小板衍化生长因子（PDGFB）兔多克隆抗体（BA0519）、山羊抗小鼠/兔IgG免疫组化检测试剂（SA1050）为武汉博士德生物工程有限公司产品，DAB显色剂为北京中杉金桥有限公司产品，抗兔IgGHRP（Sigma,A6154）。1.2 动物 健康雄性SD大鼠，8周龄，体重200220 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，动物合格证号：0052769。1.3 主要仪器 H7500透射电镜、ROCHE MODULAR全自动生化分析仪、微量血糖测定仪、Olympus公司图像采集系统、北京医学图像分析管理系统、LabworksTM扫描分析软件系统。1.4 分组、造模及给药 按参考文献1稍加修改建立模型，取SD大鼠50只禁食12 h后，用0.1 mmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液（pH4.2，4）配制浓度为2的STZ溶液，按60 mg/kg左下腹腔单次注射STZ，制造DM模型。72 h后尾尖取血测空腹血糖，血糖16.65 mmol/L确定为DM成模大鼠，共成模40只。将成模大鼠随机分成4组：模型组、JJFSN组、JJFSN+厄贝沙坦组、厄贝沙坦组各10只。另取不注射STZ大鼠10只作为正常对照组，腹腔注射等量无菌枸橼酸钠缓冲液，尾尖取血测血糖，血糖均在4.78.3 mmol/L。造模7 d后,JJFSN组用JJFSN按29.87 gkg-1 d-1灌胃；厄贝沙坦组用厄贝沙坦按50 mgkg-1d-1灌胃；JJFSN+厄贝沙坦组用JJFSN按29.87 gkg-1d-1和厄贝沙坦按50 mgkg-1d-1灌胃，每日上午1次，正常对照组和模型组大鼠每日上午用等量蒸馏水灌胃。室温1820，相对湿度69，12 h交替照明，大鼠自由饮水、进食。共喂养12 w。1.5 标本收集与检测 实验结束前1 d，用代谢笼留取24 h尿液，记录总量，离心，-80冰箱保存。实验结束，所有动物于空腹状态称体重（BW），10水合氯醛腹腔麻醉,剖腹分离双侧肾脏，右肾用冰生理盐水清洗，吸干水分，称肾重（KW），左肾取少部分皮质制备1 mm3数块，用4戊二醛固定，待做透射电镜观察，取1/2肾组织放入4多聚甲醛溶液中固定，待行病理和免疫组化。余肾脏标本均用液氮快速冷冻,-80冰箱保存，备行Western印迹检测等。24 h尿白蛋白排泄率（UAER）用ROCHE MODULAR全自动生化分析仪测定。将石蜡包埋的肾组织制成厚4 m切片，按照免疫组化三步法检测肾组织VEGF和BMP7的表达，以PBS代替一抗作为阴性对照，每个标本在400倍光镜下随机选取8个视野，采用Olympus公司图像采集系统及北航医学图像分析管理系统进行半定量分析，染色阳性部位的深浅以平均光密度值表示。取冰冻组织100 mg提取蛋白，蛋白考马斯亮蓝法定量，取蛋白SDSPAGE电泳，然后转移至聚偏氟乙稀（分子杂交，PVDF）膜上，入含6%脱脂牛奶（pH7.2）的磷酸缓冲液（PBS）中封闭室温12 h，置4冰箱过夜，洗膜后用一抗(PDGFB兔多克隆抗体)进行杂交，再用二抗(抗兔IgGHRP)进行杂交，化学发光试剂检测进行放射自显影。用LabworksTM扫描分析软件系统定积分光密度值。1.6 统计学处理 数据用xs表示，应用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，组间差异性比较采用单因素方差分析。2 结果2.1 各组大鼠KW/BW和UAER比较 模型组大鼠的KW/BW、UAER显著增高(P0.05)；JJFSN组、厄贝沙坦组和JJFSN+厄贝沙坦组上述指标显著低于模型组(P0.05)；JJFSN+厄贝沙坦组两项指标改善明显优于模型组、JJFSN组和厄贝沙坦组(P0.05)，但未达到正常对照组水平；JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义(P0.05)。见表1。表1 各组大鼠KW/BW和UAER比较（略）与模型组比较：1)P0.05；与JJFSN+厄贝沙坦组：2)P0.05，下表同2.2 各组大鼠PDGFB表达 模型组PGGFB表达(129 8001 873.8)明显高于正常对照组(432 621.51 114.3)(P0.05)；JJFSN组(98 3291 588.1)、厄贝沙坦组(98 181.01 628.2)和JJFSN+厄贝沙坦组(83 130.51 045.4)PDGFB表达明显低于模型组(P0.05)；JJFSN+厄贝沙坦组较JJFSN组和厄贝沙坦组表达降低更为显著(P0.05)，但仍高于正常对照组；JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义(P0.05)。见图1。15：厄贝沙坦组，模型组，JJFSN+厄贝沙坦组，JJFSN组，正常组图1 肾PDGFB Western印迹图片（略）2.3 各组大鼠VEGF表达 DM大鼠与正常对照组大鼠肾脏组织中VEGF免疫组化相比分布范围扩大。在正常肾组织中，VEGF主要在肾小球脏层上皮细胞及肾小管上皮细胞表达；在DM大鼠肾组织中，除在肾小球上皮细胞中阳性表达外，在部分肾小球壁层上皮细胞、系膜细胞也有表达半；半定量分析结果显示，模型组VEGF表达明显高于正常对照组(P0.05)；JJFSN组、厄贝沙坦组和JJFSN+厄贝沙坦组VEGF表达明显低于模型组(P0.05)；JJFSN+厄贝沙坦组较JJFSN组和厄贝沙坦组表达降低更为显著(P0.05)，但仍高于正常对照组；JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异不显著(P0.05)。见图2，表2。2.4 各组大鼠BMP7表达 在正常肾组织中，BMP7主要在肾小球足细胞及肾髓质的集合管和肾动脉外膜细胞表达。DM大鼠与与正常对照组大鼠肾脏组织中BMP7免疫组化相比分布范围缩小；半定量分析结果显示，模型组BMP7表达明显低于正常对照组(P0.05)；JJFSN组、厄贝沙坦组和JJFSN+厄贝沙坦组BMP7表达明显高于模型组(P0.05)；JJFSN+厄贝沙坦组较JJFSN组和厄贝沙坦组表达升高更为显著(P0.05)，但仍低于正常对照组；JJFSN组与厄贝沙坦组之间差异无统计学意义(P0.05)。见图3，表2。表2 各组大鼠肾VEGF和BMP7的表达（略）图2 肾VEGF免疫组化图片(SAB，200)（略）图3 肾BMP7免疫组化图片(SAB，200)（略）3 讨论 DN发病机制尚不完全清楚，目前认为与遗传、高血糖、血流动力学改变以及细胞因子等因素有关。PDGFB在DN的发展中起了重要作用2，可能促进细胞外基质（ECM）合成，抑制ECM降解，导致细胞ECM集聚，从而参与肾小球硬化过程3。DM大鼠肾组织PDGFB链RNA的表达及其蛋白含量均明显增高，且与DM病程成正相关4，而PDGF诱导VEGF的表达5。而VEGF具有促进内皮细胞分裂、增殖、血管生成及增加血管通透性，可促进肾小球硬化6。VEGF在DM大鼠肾脏中持续高表达，早中期以肾小球表达上调为主，中后期突出表达在肾小管表达，其表达变化与DM大鼠肾脏病变发生发展相关7。VEGF表达增加，单核巨噬细胞增加，通过smad信号传导通路下调BMP7的表达8，后者可能具有防止组织纤维化作用9。DN大鼠肾BMP7表达与尿蛋白呈负相关，BMP7表达减少可能参与了DN的发生和发展10。本研究中DM大鼠肾组织VEGF和PDGFB表达增加，而BMP7表达减少，并出现大量蛋白尿，显示肾PDGFB、VEGF增高和BMP7减少参与了DN的发生和发展。 本实验结果显示,JJFSN具有和厄贝沙坦相当的治疗作用,能够降低DM大鼠肾组织VEGF和PDGFB的表达并能升高DM大鼠肾组织BMP7表达，明显减少UEAR，减轻DM大鼠肾组织病理损伤，从而延缓肾小球硬化的进程,提示JJFSN能延缓DM大鼠肾纤维化进程,对DM大鼠肾脏具有保护作用。【参考文献】 1 高红莉，刘方永，夏作理.实验性糖尿病动物模型的理论研究与应用J.中国临床康复，2005；9（3）：20911.2 郑景晨，倪连松，汪大望，等.糖尿病大鼠肾脏细胞因子基因表达初步研究J.中国病理生理杂志，2004；20（1）：1379.3 姜晓宇，袁伟杰.PDGF对大鼠肾小球系膜细胞基质分泌的影响J.山东医药，2006；46（19）：223.4 Nakagawa H,Sasahara M,Haneda M,et al.Immunohistochemical characterization of glomerular PDGFchain and PDGF betareceptor expression in diabetic ratsJ.Diabetes Res Clin Pract,2000；48(2):8798.5 Chang HJ,Park JS,Kim MH,et al.Extracellular signaregulated kinases and AP1 mediate the upregulation of vasc